雞卵泡顆粒細胞分離

時間：2017-3-29閱讀：604

細胞系實驗動物

產(chǎn)蛋期母雞,，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食進飲；實驗前禁食12h

細胞系實驗步驟

1.翅下靜脈注射2mL EDTA-2Na（W/V,，2%）溶液處死母雞,，新潔爾滅消毒液浸泡消毒5min，打開腹腔,，剪取整個卵巢,，小心剝離卵泡（以8-15g為*），置于裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中,；

2.用加有雙抗的PBS緩沖液沖去血污,，漂洗3次；將漂洗干凈的卵泡移入裝有預冷PBS緩沖液的平皿中,，剝凈卵泡外膜,、結(jié)締組織及血管網(wǎng)；

3.用手術(shù)刀在卵泡表面劃一道1-2cm長的切口（動作要快）,，釋放卵黃,，用PBS緩沖液將剩余的卵黃液漂洗干凈，剩下的卵泡膜即為：基膜和卵泡顆粒細胞層,；

4.將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎,，置于15mL離心管中，加4mL培養(yǎng)基,，用1mL移液槍反復吹打1min,，自然沉降5min，收集上清液備用,；

5.向離心管內(nèi)加入4mL 0.2%Ⅱ型膠原酶,，重懸沉淀，置于37℃恒溫水浴鍋中消化30min,，每5min震蕩一次,；

6.消化結(jié)束，加入4mL M199*培養(yǎng)基（含10%血清）終止消化,；用200目不銹鋼篩過濾,，收集濾液，1200rpm離心5min,；

7.細胞系沉淀用M199洗2次,，室溫離心，1200rpm,，5min,；棄上清，加入M199*培養(yǎng)基（含5%FBS及1%雙抗）重懸后接種于6孔塑料培養(yǎng)皿,，置于37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),；12-24h換液，隨后每天觀察,，2-3天換液一次,，待細胞生長融合用于實驗。

雞卵泡顆粒細胞分離

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