流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)   

1.試劑盒簡(jiǎn)介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒主要感染當(dāng)年草魚(yú)種和青魚(yú),，死亡率可達(dá)80%以上,。其它淡水鯉科魚(yú)，如鰱魚(yú),、鳙魚(yú),、鯽魚(yú)、鯉魚(yú)感染后沒(méi)有臨床癥狀,，但可以攜帶病毒到處傳播,。該病在水溫高于20℃以上時(shí)流行, 25～28℃為流行高峰。常見(jiàn)的臨床癥狀為眼突出,、體色發(fā)黑,，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血,。撕開(kāi)表皮,，可見(jiàn)肌肉出現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見(jiàn)腸道充血, 肝,、脾充血或因失血而發(fā)白,。病原為草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員,。病毒為直徑70nm的球形顆粒,，有雙層衣殼，無(wú)囊膜,，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA,。根據(jù)片段長(zhǎng)度大小分為大（L1,、L2、L3,，大小在4.0kb～3.7kb）,、中（M4、M5,、M6,，大小在2.5～2.0kb）、?。⊿7,、S8、S9,、S10,、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性,、核酸電泳圖譜,、對(duì)細(xì)胞的敏感性和對(duì)魚(yú)的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個(gè)典型的代表株：GCRV-873為湖南株,，能在CO,、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主,；GCRV-9014為湖北株,，能在CIK、CO細(xì)胞中大量增殖,，但不產(chǎn)生CPE,，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%,。為了適應(yīng)草魚(yú)出血?。℅CRV）快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測(cè)GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下和質(zhì)檢,。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。本試劑盒具有快速靈敏,、特異,、準(zhǔn)確、安全、操作簡(jiǎn)單,、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn),。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑,。具體組成參見(jiàn)表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

核酸提取試劑： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對(duì)照

GCRV-9014 陽(yáng)性對(duì)照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：核酸提取試劑可使用本公司的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3,、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干,。

取新鮮魚(yú)類組織臟器（肝,、腦,、脾、腎）2g 于已洗凈,、滅菌并烘干的研缽中充分研磨,，加 5ml PBS 混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用,?；蛉∮锌梢杉?xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測(cè)。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h,；-70 ℃以下可長(zhǎng)期保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）。

3.3運(yùn)輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸,。

4,、一步法 RT-PCR 檢測(cè)

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

4.1.1.1取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對(duì)照的和（陽(yáng)性對(duì)照,、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出）,，做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板,，無(wú)需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液,，分別加入被檢樣本和陰性對(duì)照各 200 ?L，一份樣本換用一個(gè)吸頭,，再加入 200 ?L 氯,，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層,，也可以用手顛倒混勻）,，于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）,， 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,，上清液應(yīng)至少吸取 500?L,，不能吸出中間層，顛倒混勻,。

4.1.1.4于 4 ℃,、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清,，倒置于吸水紙上,，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干),；加入 600 ?L 75％ 乙醇，顛倒洗滌,。

4.1.1.5于 4 ℃,、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清,，倒置于吸水紙上,，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）,，將管壁上的殘余液體甩到管底部,，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干,，一份樣本換用一個(gè)吸頭,，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min,，不能過(guò)于干燥,，以免 RNA 不溶。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水,，輕輕混勻,，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s,，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi),。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用,，更方便快捷提取核酸】。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,；若需長(zhǎng)期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi),。

4.2、試劑準(zhǔn)備

4.2.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液,、RT-PCR混合酶,，在室溫下融化后，2 000 r/min 離心5 s,。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測(cè)總數(shù)為n,，其中n為被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和,，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)下表2,。

表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測(cè)試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中,，充分混合均勻,，向每個(gè)一步法RT-PCR管中各分裝15 μL,，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL,，蓋緊管蓋，500 r/min離心30s,。

4.3,、檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序,。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min,；

第二階段：94 oC/4 min；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min,，72 oC/1 min, 30個(gè)循環(huán),； 第四階段，72 oC/8 min,；

第五階段,，4 oC 保存。

4.4,、瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板,。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面,。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔,。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照。5 V/cm電泳約0.5 h,，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止,。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄,。

5,、結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條320bp的DNA段。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶,。

5.2待測(cè)樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶,，可判陽(yáng)性。

6,、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’