流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書   

1.試劑盒簡介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚，死亡率可達(dá)80%以上,。其它淡水鯉科魚，如鰱魚、鳙魚,、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀,，但可以攜帶病毒到處傳播,。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出,、體色發(fā)黑,，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血,。撕開表皮,，可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發(fā)白,。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus,，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒,，有雙層衣殼,，無囊膜，含有11個片段的雙鏈RNA,。根據(jù)片段長度大小分為大（L1,、L2、L3,，大小在4.0kb～3.7kb）,、中（M4、M5,、M6,，大小在2.5～2.0kb）、?。⊿7,、S8、S9,、S10,、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性,、核酸電泳圖譜,、對細(xì)胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株,，能在CO,、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主,；GCRV-9014為湖北株,，能在CIK、CO細(xì)胞中大量增殖,，但不產(chǎn)生CPE,，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%,。為了適應(yīng)草魚出血?。℅CRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下和質(zhì)檢,。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求,。本試劑盒具有快速靈敏、特異,、準(zhǔn)確、安全,、操作簡單,、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點。

2,、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑,。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

核酸提取試劑： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：核酸提取試劑可使用本公司的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干,。

取新鮮魚類組織臟器（肝,、腦、脾,、腎）2g 于已洗凈,、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻,，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用,。或取有可疑細(xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測,。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h,；-70 ℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）,。

3.3運(yùn)輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸,。

4、一步法 RT-PCR 檢測

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

4.1.1.1取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照,、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記,。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,，無需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L,，一份樣本換用一個吸頭,，再加入 200 ?L 氯，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強(qiáng)烈,，以免產(chǎn)生乳化層,，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min,。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）,， 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,，上清液應(yīng)至少吸取 500?L,，不能吸出中間層，顛倒混勻,。

4.1.1.4于 4 ℃,、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清,，倒置于吸水紙上,，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％ 乙醇,，顛倒洗滌,。

4.1.1.5于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）,，小心倒去上清,，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）,。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）,，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清,，用微量加樣器將其吸干,，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面,，室溫干燥 3 min,，不能過于干燥，以免 RNA 不溶,。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水,，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA,，2 000 r/min 離心 5 s,，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi),。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】,。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.2,、試劑準(zhǔn)備

4.2.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液,、RT-PCR混合酶,，在室溫下融化后，2 000 r/min 離心5 s,。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n,，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和,，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表2,。

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中,，充分混合均勻，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL,，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋,，500 r/min離心30s,。

4.3、檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi),，記錄樣本擺放順序,。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min,；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min,，72 oC/1 min, 30個循環(huán)； 第四階段,，72 oC/8 min,；

第五階段，4 oC 保存,。

4.4,、瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽,，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面,。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照,。5 V/cm電泳約0.5 h,，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶,，拍攝并記錄,。

5、結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA段,。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶,。

5.2待測樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶,，可判陽性。

6,、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’