大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的含量,。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平。用純化的大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被的微孔中依次加入大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）含量,。

試劑盒組成：

試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存

說(shuō)明書(shū) 1份 1份

封板膜 2片 2片

密封袋 1個(gè) 1個(gè)

酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品 0.3ml×6管 0.3ml×6管 2-8℃保存

酶標(biāo)試劑 5 ml×1瓶 10 ml×1瓶 2-8℃保存

樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

終止液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

20×濃縮洗滌液 15ml×1瓶 25ml×1瓶 2-8℃保存

注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：120、60,、30,、15,、7.5、0 ng/mL.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用,。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；,。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,。

3.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl,，空白孔除外。

4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。

5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。

6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 

8.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行,。

注意事項(xiàng)：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間hao控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，hao做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第yi孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異,，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo),，    

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，根據(jù)樣品的OD      

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式,，將樣品的OD值      

代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。                  

（此圖僅供參考）

 試劑盒性能：

1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上,。

2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

檢測(cè)范圍：                                              

3.75 ng/mL - 120 ng/mL

 靈敏度：                                              

低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL

 保存條件及有效期：

1.試劑盒保存： 2-8℃,。

2．有效期： 6個(gè)月