豬鉤端螺旋體抗體IgG （Lep-IgG）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測豬血清,，血漿中豬鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG)水平。

實驗原理：

  本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標(biāo)本中豬鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG),。用純化的抗原包被微孔板,，制成固相抗原，可與樣品中鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG)相結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合,，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較,，從而判定標(biāo)本中豬鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG)的存在與否,。

試劑盒組成：

試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存

說明書 1份 1份  

封板膜 2片（48） 2片（96）  

密封袋 1個 1個  

酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

陰性對照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

陽性對照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存

濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實行,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。

6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

豬鉤端螺旋體抗體IgG （Lep-IgG）ELISA試劑盒操作步驟：

?編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號,，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔,、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）

?加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照,、陽性對照50μl,。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，

?溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。   

?配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

?加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。

?溫育：操作同3,。

?洗滌：操作同5。

?顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl,，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘

?終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

?測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

結(jié)果判定：

  試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

  臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為人鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG)陰性

  陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為人鉤端螺旋體抗體IgG (Lep-IgG)陽性

注意事項

1．操作嚴(yán)格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用,。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。

?封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存,。

6．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

7．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全,。

豬鉤端螺旋體抗體IgG （Lep-IgG）ELISA試劑盒保存條件及有效期

1．試劑盒保存：,；2-8℃。

2．有效期：6個月