人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被人抗AECA抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原,，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）的存在與否,。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞
刺激，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地
分離,。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于
-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。3. 預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,，直接取50μL 加樣即可。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無(wú)
陰性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)
陽(yáng)性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)
檢測(cè)抗原-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A 6mL 3mL 無(wú)
底物B 6mL 3mL 無(wú)
終止液6mL 3mL 無(wú)
封板膜2 張2 張無(wú)
說(shuō)明書1 份1 份無(wú)
自封袋1 個(gè)1 個(gè)無(wú)
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水,。
人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min 后甩盡
孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次,。
2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5 次,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、
陽(yáng)性對(duì)照各50μL,；
3. 待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本50μL；
4. 隨后陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）
標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫
箱溫育60min,。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去
洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL,，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi),，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的
OD 值。
結(jié)果判斷
1. 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值平均值≥1.00,；
陰性對(duì)照孔OD 值平均值≤0.15,。
2. 臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性
4. 陽(yáng)性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off）,，樣品為陽(yáng)性
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD 值平均
值≤0.15,，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。
2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。
4. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
5. 人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒有效期：6 個(gè)月