人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被人抗AECA抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、HRP標(biāo)記的檢測抗原,，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值）,，與CUTOFF值相比較,，從而判定標(biāo)本中人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）的存在與否。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞
刺激，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地
分離,。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝,，凍存于
-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用,。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。3. 預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取50μL 加樣即可,。
4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無
陰性對照0.5mL 0.5mL 無
陽性對照0.5mL 0.5mL 無
檢測抗原-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋,，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水。
人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min 后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,，如此洗板5 次,。
2. 自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5 次,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封
袋密封放回4℃,。
2. 設(shè)置陰,、陽性對照孔和樣本孔，陰,、陽性對照孔中加入陰性對照,、
陽性對照各50μL；
3. 待測樣本孔加待測樣本50μL,；
4. 隨后陰,、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）
標(biāo)記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫
箱溫育60min,。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去
洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6. 每孔加入底物A,、B 各50μL，37℃避光孵育15min,。7. 每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值,。
結(jié)果判斷
1. 試驗有效性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00,；
陰性對照孔OD 值平均值≤0.15。
2. 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性
4. 陽性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off）,，樣品為陽性
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對照孔OD 值平均
值≤0.15，說明試驗結(jié)果有效,。
2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%,。
4. 貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。
5. 人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）ELISA試劑盒有效期：6 個月