人尿吡啶啉（PYD）ELISA檢測試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被尿吡啶啉（PYD）抗體的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的尿吡啶啉（PYD）呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞
刺激,，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。
3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝,，凍存于
-20℃,，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘,。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用,。
2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。
3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白,；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5 倍，zui終結(jié)果乘以5 才是樣本實際濃度,。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0,、50、100,、200,、400、800 pg/mL
人尿吡啶啉（PYD）ELISA檢測試劑盒試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋,，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水,。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min 后甩盡
孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次,。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5 次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封
袋密封放回4℃,。
2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
3. 樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不
加,。
4. 除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min,。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去
洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5 次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A,、B 各50μL,，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi),，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在Excel 工作表中,，以標準品濃度作橫坐標,，對應
OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣
本濃度值,。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R 值，大于等于
0.9900,。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 pg/mL,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
4. 重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
6.人尿吡啶啉（PYD）ELISA檢測試劑盒 有效期：6 個月