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小鼠血管平滑肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原理

時(shí)間:2017-7-27閱讀:1581
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小鼠血管平滑肌細(xì)胞描述: 
小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖能力取決于細(xì)胞取材,、培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)條件等綜合因素,。請(qǐng)按照正確的培養(yǎng)方法來解凍,、傳代,以此保證細(xì)胞具備良好的增殖能力,,方便您的后繼研究順利進(jìn)行,。 
小鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞主要功能:
(1)  血管平滑肌細(xì)胞的再生能力可引發(fā)血管病變。
(2)   細(xì)胞表達(dá)ICAM-1和VCAM-1,,能促進(jìn)血管壁中炎癥反應(yīng)并對(duì)血管疾病的發(fā)展和穩(wěn)定起著重要作用,。
小鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞與主要病生理變化:
(1)腦動(dòng)脈硬化,。
(2)腦動(dòng)脈血管瘤,。
小鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的基本特性:
(1) 組織來源于正常小鼠腦動(dòng)脈組織,。
(2) 鑒定:肌動(dòng)蛋白,alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色,。
(3  原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存,。
(4)每?jī)龃婀芗?xì)胞數(shù):>1×106個(gè)/管/1ml。
(5)肌動(dòng)蛋白,,alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色驗(yàn)證,。
(6)不含有HIV-1、 HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌,。
質(zhì)量控制: 本細(xì)胞經(jīng)過了檢測(cè),不含有細(xì)菌,、真菌,、病毒(HIV、HBV,、HCV),、支原體。 
培養(yǎng)條件:37℃,,5% CO2,,PH值7.2~7.4,無菌恒溫培養(yǎng),。 
用途: 本產(chǎn)品只提供給進(jìn)一步的科研使用,,不可應(yīng)用于治療等其他方面。
細(xì)胞相關(guān)操作(注意:細(xì)胞操作都需嚴(yán)格按照無菌操作)
收到復(fù)蘇好的貼壁細(xì)胞的處理方法:
先從外包裝盒拿出細(xì)胞瓶,,在細(xì)胞瓶表面噴一層酒精,,并小心去掉封口膜;
在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),,并確定是否染菌,,如有染菌,請(qǐng)立即拍照,,并將細(xì)胞丟掉,;
將培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí),;
倒掉多余的培養(yǎng)基,,留正常體積的培養(yǎng)基;
重新將培養(yǎng)瓶置于37°C,,5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜
6. 第二天傳代,。
收到凍存細(xì)胞的處理方法:
1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基,;
從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍(解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞);
在超凈臺(tái)中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,,1000rpm離心5min,;
4.棄上清,加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中,,輕輕晃勻,;
5.置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)瓶蓋沒有透氣孔的話,,瓶蓋不要擰太緊),;
6.第二天,用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng),。
小鼠血管平滑肌細(xì)胞傳代
1.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí),,給細(xì)胞傳代;
2.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基,;
3.在超凈臺(tái)中,,棄培養(yǎng)基,加入2-5mlPBS清洗細(xì)胞后,,再加入1ml胰酶消化細(xì)胞,;
4.顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,有細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí),,加入5ml培養(yǎng)基終止消化,;
5.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞,并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散,;
6.將細(xì)胞移入離心管中,,1000rpm離心5min;
7.棄上清,,加入15-20ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中或按適當(dāng)比例傳到T25瓶中(確保細(xì)胞貼壁后融合度在25-50%之間),,細(xì)胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶),混勻細(xì)胞懸液,,確保均勻分布,;
8.將培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
細(xì)胞凍存
1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基,;
2.消化細(xì)胞后給細(xì)胞計(jì)數(shù):
1)洗凈晾干血小板計(jì)數(shù)板和蓋玻片,將蓋玻片*覆蓋計(jì)數(shù)區(qū),;
2)充分混勻細(xì)胞,,取少量(0.1-0.5ml)細(xì)胞懸液與等體積的染色液臺(tái)盼藍(lán)混合,移液器吹吸混合均勻,用移液器取20ul混合液從蓋玻片兩端(與中間凹槽平行的兩端)分別打入細(xì)胞,,以細(xì)胞懸液剛好浸濕蓋玻片為佳,;
3)顯微鏡下,數(shù)四個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的總細(xì)胞數(shù),,無活性細(xì)胞染成藍(lán)色,活細(xì)胞不被染色,;
4)細(xì)胞密度=細(xì)胞總數(shù)/4×10000×2,;
這里10000是不變的,因?yàn)橛?jì)數(shù)的細(xì)胞是在體積為1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3計(jì)數(shù)池內(nèi),,1cm3=1ml,,將四個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的細(xì)胞數(shù)除以4取平均數(shù),乘2是補(bǔ)償加等體積臺(tái)盼藍(lán)形成的稀釋,。
5)細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%,。
注:細(xì)胞密度高時(shí),可調(diào)整細(xì)胞懸液和臺(tái)盼藍(lán)的比例,,計(jì)數(shù)時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可,。
3.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到傳代密度且細(xì)胞活性在90%以上時(shí),可以凍存細(xì)胞,。
4.在超凈臺(tái)中將要凍存的細(xì)胞移入離心管,,1000rpm離心5min。
5.棄上清,,用90%培養(yǎng)液+10%DMSO的混合液重懸細(xì)胞,,并調(diào)整細(xì)胞密度為1-3×106/ml。
6.將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中(1-1.5ml/管),。
7.將裝有小鼠血管平滑肌細(xì)胞的凍存管放入程序降溫凍存盒,,-20°C放1-2h后,-80°C過夜,,然后快速轉(zhuǎn)移到液氮中,。

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