研究了很久的原代細(xì)胞培養(yǎng),，如何能夠使細(xì)胞形態(tài)更好、養(yǎng)的更漂亮,，在此把一些經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)總結(jié)分享給大家,！
不同的細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求不一樣
這個(gè)不僅僅是說培養(yǎng)基的不同,，還有就是細(xì)胞生長的空間密度問題,。有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長，生長狀態(tài)也比較好,。這種一般是屬于生長速度慢的細(xì)胞,。譬如內(nèi)皮細(xì)胞,。而有一些是細(xì)胞是數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會(huì)生長的比較好，譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞,。
尤其是巨噬細(xì)胞,，生長速度非常得快，貼壁速度很快,，所以傳代時(shí)就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞,，這樣細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比較好。并且巨噬細(xì)胞比較喜歡扎堆生長,，而堆與堆之間是有空間的,。如果長成相連在一起的一滿片的時(shí)候，細(xì)胞形態(tài)基本上就會(huì)差了,，老化的會(huì)比較多,，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不好的。
所以在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長空間密度,。
養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好,？
對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果細(xì)胞形態(tài)不好,，或者細(xì)胞形態(tài)不清晰,，表面似有異物等，可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：
      首先,，倒掉舊的培養(yǎng)基,，加入 3 mL 新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走,。然后再加入 3 mL 的培養(yǎng)基,，進(jìn)行預(yù)吹打，控制吹打力度,，輕輕地大概沿著瓶底過一遍,，然后吸走。這時(shí)侯再開始正式的消化,、吹打,。
注：巨噬細(xì)胞我們只吹打，不消化的,。
其次,，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基,，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況,。10 分鐘觀察一次,，20 分鐘,，30 分鐘觀察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn),，已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下,，重新置于潔凈臺(tái),，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基,，加入 3 mL 新培養(yǎng)基再輕輕洗一次,。然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng),。后續(xù)觀察細(xì)胞生長情況以及形態(tài),。這就是二傳,。
如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次,。直到找到細(xì)胞形態(tài),。其中要注意結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長情況。喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳,。反之亦然,。這個(gè)方法真的很好用,。
培養(yǎng)基的量的問題
這個(gè)是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的,。并不是小的玻璃方瓶 12 mL,，大方瓶14mL 的,。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長得比較好。對(duì)于生長速度快的細(xì)胞,，易生長的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好,。但是要注意換液掌握,。
培養(yǎng)瓶選擇的問題
個(gè)人發(fā)現(xiàn)生長速度快的細(xì)胞在玻璃瓶內(nèi)生長的狀態(tài)會(huì)比一次性塑料瓶相對(duì)好一些,。而對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶內(nèi)的生長狀態(tài)也比塑料瓶內(nèi)好,。這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁。生長速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)更安逸的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài),，塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好，對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞,，玻璃瓶則會(huì)更好,。同樣，對(duì)于同一種細(xì)胞,，在其生長速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì)好一點(diǎn),，比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候，或者原代培養(yǎng)的時(shí)候,。而在其生長旺盛的時(shí)候,，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn),。
傳代時(shí)消化的問題
      可以這樣說，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞,，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否,，狀態(tài)好與不好zui至關(guān)重要的考驗(yàn)。
很多同學(xué)都遇到過這個(gè)問題,，自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長的還挺好的，可是穿過幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了,，狀態(tài)越來越差勁了,。對(duì)于這個(gè)問題，可以非?？隙ǖ卣f,，你的消化環(huán)節(jié)出問題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了,。所以,，越長越差。
      在消化的過程中，你加入胰酶后,，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著,，但是我們忽視了一個(gè)問題就是，細(xì)胞的生長狀態(tài)是不一樣的,，每一個(gè)原代細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的,，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的,，所以,，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是不公平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會(huì)有脾氣啊,。我后來對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良,，我稱之為四步消化法，以難消化細(xì)胞為例,，具體操作如下：
1.首先不加胰酶,，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍。這是前奏,，即為*步,，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。
2.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍,，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來,。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶,，即為第二步。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng),，以與后面胰酶消化過的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰長的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度了,。
3.吸干凈瓶內(nèi)剩余液體，加入 0.3 mL 左右的胰酶潤洗一遍,，吸掉棄之,，再加入 1 mL 左右的胰酶消化,。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打,，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存,。用 2 mL 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng),，以與后面及前面的做對(duì)比,。這是第三步。
4.然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞,。當(dāng)然你也可以用新的胰酶,，如果你們那比較富裕的話,。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯,，細(xì)胞獨(dú)立開來的時(shí)候,，吸掉胰酶,，加入新培養(yǎng)基吹打,。懸液傳入新瓶培養(yǎng),，以實(shí)際情況你自己把握。
其實(shí)還可以有第五步,，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步,。為了細(xì)胞更好的狀態(tài),，更漂亮的樣子，沒辦法,，你必須分多批多次消化,，這樣才能zui大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到zui低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠*,。
當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞,，像 RAW264.7,，僅僅第二步就搞定了。就沒必要第三步第四步了,。這個(gè)是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會(huì)的,。建議你接手一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求,，便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展,。
將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是,，可以zui大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài),，不成片不連體。
因?yàn)榧?xì)胞生長的時(shí)候肯定是要相互,，大部分的細(xì)胞都是要成片生長的,，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長著長著就長到一片去了,。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話,，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡,。所以,，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)是非?？季磕愕墓Ψ虻?。
細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè)，因?yàn)樗麤]有受力點(diǎn)了,。很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)他吹打的力分散開細(xì)胞,。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方,。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度,，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理。
既要消化到容易吹打下來,，又不能太過,，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉,。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開,。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活或死的致命點(diǎn),，像 Caco-2 細(xì)胞就是如此,。
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長到 70% 左右的時(shí)候就要傳代了,，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長中已經(jīng)有疊層生長的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代,，不能再拖。
換液傳代時(shí)候洗瓶的問題
對(duì)于用 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞,，你在洗的時(shí)候如果是用無血清 1640 去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用 DMEM 洗的長的要好,。同樣，用 1640 培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象,。
如果不嫌麻煩的話,，可以用 PBS 來洗,，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝*,。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清,，防止它對(duì)胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先,，是很關(guān)鍵的一點(diǎn),。
使用 PBS 洗是很重要的一步，zui近發(fā)現(xiàn),，用 PBS 就可以把細(xì)胞消化開來,。加入 PBS 放置 10 ~ 15 分鐘，有些需要更長的時(shí)間,，等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開來的時(shí)候,，就可以直接吹打下來，但是和胰酶消化一樣,，要控制好時(shí)間,，不能時(shí)間太過了，要不然損傷細(xì)胞,，細(xì)胞不容易成活,，狀態(tài)容易不好。這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的,。有些原代細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候,，或者臨時(shí)沒有胰酶了，可以選用此方法,。不過一定要試試,，看是否適合你的細(xì)胞。