非酶消化法(EDTA消化法)

EDTA是一種非酶消化物,，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸,。常用不含鈣,、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)一些組織,，尤其是上皮組織分散效果好,，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊,，常不單獨(dú)使用,，但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散,，可降低胰酶的用量和毒性作用,。

消化分離法的操作步驟：

(1)剪切 把組織塊剪碎,，呈1~5mm3大小的組織塊。

(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜,，自然沉降法),。

(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止,，若變化不大可更換一次消化液,，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),。

(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液,。

(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,，中止消化反應(yīng),，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基,。

(6)機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法,，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)如下：

(1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣,、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用,。

(2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng),，以避免毒性作用,。

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生,，而且動(dòng)作要輕,，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。