原代細(xì)胞要素一：細(xì)胞

分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA,。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過(guò)度生長(zhǎng)的狀態(tài);此外,，還常用促有絲分裂刺激物(如,，病毒轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)因子,，條件培養(yǎng)基,，以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來(lái)活化原代培養(yǎng)細(xì)胞,。

貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對(duì)于貼壁細(xì)胞(如HEK,，CHO),，懸浮細(xì)胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染,，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異,，但目前還沒(méi)有分子水平上合理機(jī)制的解釋。

要素二：載體DNA

一般原則：對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定,。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系,。在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照,。

載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性,。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂,、核酸酶的降解,，以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。

載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化,。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl,，內(nèi)毒素)可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

載體構(gòu)造(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如,，RSV,，CMV，和SV40)的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較,。然而,，病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如,，在某些細(xì)胞系中,，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可表達(dá)large T抗原(如,，COS);而在其他許多細(xì)胞系中,，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。

除此之外,，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異,，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。

要素三：組織培養(yǎng)試劑

一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件,。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,，并盡可能減少所用試劑的變更。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,，葡萄糖),，維生素,，無(wú)機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì),。有些成分非常不穩(wěn)定,，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題,。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì),，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì),。

胎牛血清——血清是一種含有白蛋白,、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)抑制因子的極為復(fù)雜的混和物,。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量,，從而引起顯著生物學(xué)變化,。

添加劑——某些原代細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于一些對(duì)生命力或細(xì)胞分裂*的物質(zhì)(如，生長(zhǎng)因子,，微量元素,，必需代謝物和蛋白等)。

CO2培養(yǎng)箱——細(xì)胞生長(zhǎng)所需環(huán)境為37℃,、相對(duì)濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱,。用CO2是為了控制pH值，細(xì)胞生理對(duì)pH的變化非常敏感,，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系,。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來(lái)有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2,。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對(duì)一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度,。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異,。來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物,、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理,。

要素四：使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白

以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量,，必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集,。而挑選這樣一個(gè)細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間,，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性,，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活,，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低,。而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)速度大大超過(guò)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白,。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，就可獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá),。

要素五：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的*步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體,。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來(lái)幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。

一旦選好了質(zhì)粒載體,，無(wú)論瞬時(shí)或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法,。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng),。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用,。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死,。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長(zhǎng),。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中,，以維持對(duì)細(xì)胞的選擇壓力,。

要素六：轉(zhuǎn)染方案

一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開(kāi)始，然后通過(guò)改變?cè)噭?DNA的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化,。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比,，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值,，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能,。質(zhì)粒可用無(wú)菌水或TE緩沖液稀釋,。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑,，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清,，它就會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制,。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的*孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對(duì)于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大,。

轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比)——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)zui為有效,。有時(shí)候這種*配比的所在范圍非常狹窄;而且對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到*配比。

形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑——對(duì)于多數(shù)試劑而言,，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成,。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入——有兩種替換方法可用來(lái)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1.將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作,。*種方法更簡(jiǎn)便,，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以會(huì)使結(jié)果的一致性更好,。

要素七：時(shí)間進(jìn)度

一般原則提示：要確保zui終結(jié)果的成功;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到*表達(dá),。

轉(zhuǎn)染的開(kāi)始——在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中,。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染,，這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100%的融合。細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成,。在這段時(shí)間后,，就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長(zhǎng)。

時(shí)間測(cè)定——轉(zhuǎn)染開(kāi)始后的24-48小時(shí)內(nèi),，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度,、表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài),，以及營(yíng)養(yǎng)因素等,。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見(jiàn)了。

zui后就是平時(shí)可能會(huì)忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect,，轉(zhuǎn)染試劑本身對(duì)基因表達(dá)水平(高表達(dá)或低表達(dá))的影響，有時(shí)候可能會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果,。

要素八：交叉污染

如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞,，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循zui嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生,。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染,。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的原代細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種,，幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì)*取代目標(biāo)培養(yǎng)物,。