細胞培養(yǎng)常規(guī)檢查

(一)一般形態(tài)觀察

生長狀態(tài)良好的細胞在普通顯微鏡下觀察時可見,，細胞透明度大，輪廓不清,，只有用相差顯微鏡觀察,，才能看清細胞的細微結(jié)構(gòu)。細胞內(nèi)顆粒少,、無空泡,，胞膜清晰，培養(yǎng)上清液清澈透明,，看不到懸浮細胞和碎片,；細胞功能不良時，輪廓增強,，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡,、脂滴和其他顆粒狀物，細胞之間空隙加大,，細胞形態(tài)可變得不規(guī)則,，甚至失去原有特點。只有生長狀態(tài)良好的細胞才能用于實驗,。

細胞生長過程中,，CO2積累增多，由于培養(yǎng)液內(nèi)含有pH指示劑,，因此其顏色變化可間接反映細胞的生長狀態(tài),。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色,；呈橙黃色時,，細胞一般生長狀態(tài)較好；呈淡黃色,，則可能是培養(yǎng)時間過長,、營養(yǎng)不足、細胞死亡過多,；呈紫紅色,，則可能是細胞生長狀態(tài)不好，或已死亡,。

（二）細胞增殖生長狀態(tài)

初代或傳代培養(yǎng)時,，都有一長短不同的潛伏期,。傳代細胞系、胚胎組織或幼體組織潛伏期短,，一般在第二天即可見細胞生長,，一周內(nèi)便可連接成片,。成體組織的潛伏期長，老齡組織和癌組織更長,，有時可達一周左右。

初代組織塊培養(yǎng)法細胞生長,，zui先從組織“長”出的為游走細胞，它們多單獨活動,，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微攝電影法可顯示出極活躍的變形,、游走和吞噬活動。在游走細胞之后,，接著長出的是成纖維細胞或上皮細胞,。只有當出現(xiàn)細胞分裂,、細胞數(shù)量逐漸增多、形成較大生長暈或連接成片時,，細胞才真正進入增殖狀態(tài)。成纖維細胞是zui易生長細胞,，生長速度較快，低倍鏡下觀察時,，前哨部位細胞似火焰狀或放射形狀向外擴展；如接種為游走細胞,、膠質(zhì)細胞等細胞,，在密度不大時,，可連接成網(wǎng)狀,，只有細胞密度增大時才連接成片。

上皮細胞排列緊密,，相互接壤成膜狀；上皮膜邊緣整齊,，細胞很少單獨活動,，生長時整個上皮膜發(fā)生移動,。上皮細胞尤其是外胚層來源的細胞如表皮細胞等，生長過程中常產(chǎn)生溶解酶,，能使細胞間質(zhì)發(fā)生液化,，導(dǎo)致細胞相互分離,，嚴重時可導(dǎo)致細胞脫落，其確切機制尚不明了．可能與產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶有關(guān),。

細胞接種后,，經(jīng)過懸浮期,、潛伏期和指數(shù)增生期等后，zui終將長滿瓶壁,，如不及時做再培養(yǎng),，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累,，細胞即進入停滯期。此時細胞輪廓增強,，細胞內(nèi)常出現(xiàn)前述有膨脹線粒體形成的堆積物,，細胞變得粗糙,，嚴重時細胞從瓶壁脫落，只有及時做傳代,，才能使細胞繼續(xù)生長,。

(三)微生物污染

在長時間反復(fù)培養(yǎng)過程中,，即使細胞培養(yǎng)用品消毒操作嚴密,，也會偶爾發(fā)生細菌、支原體,、真菌、病毒和其他雜質(zhì)細胞污染,，需隨時注意,，一旦發(fā)生污染，應(yīng)及時進行處理,。

(四)培養(yǎng)液

在正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7．2～7．4,，呈紅色,。用一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，隨細胞生長時間延長,，CO2積累增多,，在超過緩沖范圍之后，營養(yǎng)液酸化逐漸變黃色,，這時如不
及時調(diào)節(jié)pH，會對細胞產(chǎn)生不利影響,，嚴重時可使細胞退變死亡,。培養(yǎng)液中加N-(2-羥乙基)N’-2-乙烷磺酸（N-2 Hydroxyethylpiperazme-N’-2-ethanesulionicacid,，HEPES)或用5％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)液時,，可因瓶口漏氣,，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔,，殘留堿性物質(zhì)所致,，使之變?yōu)閴A性而呈紅色,。更換營養(yǎng)液的時間，可依據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗而定,，細胞生長旺盛時,，2～3d更換一次；生長緩慢時,，3～4d更換為宜,。需特別注意,，各種細胞對pH的要求不同。