細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)檢查

(一)一般形態(tài)觀察

生長狀態(tài)良好的細(xì)胞在普通顯微鏡下觀察時可見,，細(xì)胞透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡觀察,，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu),。細(xì)胞內(nèi)顆粒少、無空泡,，胞膜清晰,，培養(yǎng)上清液清澈透明，看不到懸浮細(xì)胞和碎片,；細(xì)胞功能不良時,，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡,、脂滴和其他顆粒狀物,，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則,，甚至失去原有特點,。只有生長狀態(tài)良好的細(xì)胞才能用于實驗。

細(xì)胞生長過程中,，CO2積累增多,，由于培養(yǎng)液內(nèi)含有pH指示劑，因此其顏色變化可間接反映細(xì)胞的生長狀態(tài),。正常情況下,，培養(yǎng)液呈桃紅色；呈橙黃色時,，細(xì)胞一般生長狀態(tài)較好,；呈淡黃色，則可能是培養(yǎng)時間過長,、營養(yǎng)不足,、細(xì)胞死亡過多；呈紫紅色,，則可能是細(xì)胞生長狀態(tài)不好,，或已死亡。

（二）細(xì)胞增殖生長狀態(tài)

初代或傳代培養(yǎng)時,，都有一長短不同的潛伏期,。傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體組織潛伏期短,，一般在第二天即可見細(xì)胞生長,，一周內(nèi)便可連接成片,。成體組織的潛伏期長,，老齡組織和癌組織更長，有時可達(dá)一周左右。

初代組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞生長,，zui先從組織“長”出的為游走細(xì)胞,，它們多單獨活動，形態(tài)不規(guī)則,，用縮時逐格顯微攝電影法可顯示出極活躍的變形,、游走和吞噬活動。在游走細(xì)胞之后,，接著長出的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞,。只有當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,、形成較大生長暈或連接成片時,，細(xì)胞才真正進(jìn)入增殖狀態(tài)。成纖維細(xì)胞是zui易生長細(xì)胞,，生長速度較快,，低倍鏡下觀察時，前哨部位細(xì)胞似火焰狀或放射形狀向外擴(kuò)展,；如接種為游走細(xì)胞,、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞，在密度不大時,，可連接成網(wǎng)狀,，只有細(xì)胞密度增大時才連接成片。

上皮細(xì)胞排列緊密,，相互接壤成膜狀,；上皮膜邊緣整齊，細(xì)胞很少單獨活動,，生長時整個上皮膜發(fā)生移動,。上皮細(xì)胞尤其是外胚層來源的細(xì)胞如表皮細(xì)胞等，生長過程中常產(chǎn)生溶解酶,，能使細(xì)胞間質(zhì)發(fā)生液化,，導(dǎo)致細(xì)胞相互分離，嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞脫落,，其確切機(jī)制尚不明了．可能與產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶有關(guān),。

細(xì)胞接種后，經(jīng)過懸浮期,、潛伏期和指數(shù)增生期等后,，zui終將長滿瓶壁，如不及時做再培養(yǎng),，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累,，細(xì)胞即進(jìn)入停滯期,。此時細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)常出現(xiàn)前述有膨脹線粒體形成的堆積物,，細(xì)胞變得粗糙,，嚴(yán)重時細(xì)胞從瓶壁脫落，只有及時做傳代,，才能使細(xì)胞繼續(xù)生長,。

(三)微生物污染

在長時間反復(fù)培養(yǎng)過程中，即使細(xì)胞培養(yǎng)用品消毒操作嚴(yán)密,，也會偶爾發(fā)生細(xì)菌,、支原體、真菌,、病毒和其他雜質(zhì)細(xì)胞污染,，需隨時注意，一旦發(fā)生污染,，應(yīng)及時進(jìn)行處理,。

(四)培養(yǎng)液

在正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7．2～7．4,，呈紅色,。用一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，隨細(xì)胞生長時間延長,，CO2積累增多,，在超過緩沖范圍之后，營養(yǎng)液酸化逐漸變黃色,，這時如不
及時調(diào)節(jié)pH,，會對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時可使細(xì)胞退變死亡,。培養(yǎng)液中加N-(2-羥乙基)N’-2-乙烷磺酸（N-2 Hydroxyethylpiperazme-N’-2-ethanesulionicacid,，HEPES)或用5％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)液時,，可因瓶口漏氣,，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔,，殘留堿性物質(zhì)所致,，使之變?yōu)閴A性而呈紅色。更換營養(yǎng)液的時間,，可依據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗而定,，細(xì)胞生長旺盛時，2～3d更換一次,；生長緩慢時,，3～4d更換為宜,。需特別注意，各種細(xì)胞對pH的要求不同,。