細(xì)胞如何做好轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及提高實(shí)驗(yàn)效率

① 從健康細(xì)胞開始

Ⅰ 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前,，細(xì)胞解凍后傳代3–4次。 這使得細(xì)胞從解凍過程中恢復(fù)過來,，并恢復(fù)正常的生長速度,。

Ⅱ 僅使用活性 >90%的細(xì)胞——使用臺盼藍(lán)染色可輕松測定細(xì)胞活性。

Ⅲ 定期傳代細(xì)胞,，切勿讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)或過度生長,。如果讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)，可能會改變細(xì)胞的生長速度以及形態(tài),。a. 請在匯合率達(dá)到90%之前對細(xì)胞進(jìn)行傳代,。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細(xì)胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲在通風(fēng)櫥中,?？赏ㄟ^添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體,，僅留可覆蓋瓶子表面的液體,。

b. 傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。 部分經(jīng)驗(yàn)法則：

對于快速生長的細(xì)胞,，倍增時間為16小時(如HEK-293),，按1：10的比例分瓶,。

對于生長緩慢的細(xì)胞,，倍增時間為36小時(如原代細(xì)胞),，按1：5的比例分瓶。

Ⅳ 保留凍存的細(xì)胞系,，并定期解凍新細(xì)胞,。 傳代次數(shù)高(>30–40)時，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會改變,。

② 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,，請先規(guī)劃您的實(shí)驗(yàn)。

務(wù)必要熟悉實(shí)驗(yàn)方案,、確定所需的材料量,，并在開始實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)所需的一切物品條件均已齊備。

Ⅰ 開始前,，設(shè)計好鋪板路線圖,，標(biāo)注好每次處理或?qū)嶒?yàn)條件。

Ⅱ 計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,，并確認(rèn)有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養(yǎng)基(Corning 40-300-CVR),，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL),。

③ 轉(zhuǎn)染時,，請使用DNA。

Ⅰ 使用無內(nèi)毒素的試劑盒和實(shí)驗(yàn)方案制備DNA,。

Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度,，測得的OD值應(yīng)介于1.7–1.9]之間。數(shù)值過高或過低均說明有雜質(zhì),，不宜用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),。

Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。

Ⅳ 制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL,。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如,，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉(zhuǎn)染當(dāng)天,，將細(xì)胞鋪板,。

Ⅰ 如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降,。

Ⅱ 轉(zhuǎn)染時,，細(xì)胞密度保持在匯合率為70–90%。

Ⅲ 轉(zhuǎn)染時,，細(xì)胞密度影響轉(zhuǎn)染效率,。 為了簡化轉(zhuǎn)染優(yōu)化過程或節(jié)省時間,，我們建議細(xì)胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉(zhuǎn)染效率,。

Ⅳ 細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染可同時進(jìn)行,，或者通過反向轉(zhuǎn)染操作進(jìn)行。 反向轉(zhuǎn)染操作中,，使用的細(xì)胞是正常/正向轉(zhuǎn)染的2.5倍以上,。

Ⅴ 轉(zhuǎn)染復(fù)合物可以加到含抗生素和血清的培養(yǎng)基中，且不會影響轉(zhuǎn)染效率,。