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馬內(nèi)菲青霉探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒使用方法

時(shí)間:2021/5/13閱讀:303
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馬內(nèi)菲青霉探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒使用方法:

一,、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意:DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素,。如果不能很好純化樣品DNA,,后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二,、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線(以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分),。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽(yáng)性對(duì)照,,只提供沒有傳染性的,、可以直接使用的DN段作為陽(yáng)性對(duì)照,。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為6,,5,,4,3,,2和1號(hào),。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水(用帶芯槍頭,下同),。
3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL(注:請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL,,建議每次稀釋10倍,梯度稀釋至10E7拷貝/μL),。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),,充分震蕩1分鐘,得10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。
5. 換槍頭,,從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中,充分震蕩1分鐘,,得10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。
6. 換槍頭,從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中,,重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。
7. NC管中不加任何陽(yáng)性對(duì)照,。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR(見下步),,每個(gè)樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值,,并以之為縱軸,,以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

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