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歐洲放線菌探針法熒光定量PCR試劑盒反應的特異性決定因素:
1.引物與模板DNA特異正確的結合。
2.堿基配對原則,。
3. Tag DNA聚合酶合成反應的忠實性,。
4.靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵,。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的,。聚合酶合成反應的忠實性及 Tag DNA聚合醇耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大増加加,被擴増的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高,。
靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式増加的,能將皮克(pg=10-129)量級的起始待測模板擴増到微克(ug=10-69)水平,。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中zu小檢出率為3個細菌。
(3)簡便,、快速
PCR反應用耐高溫的 Tag DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴増液和水浴鍋上進行變性退火-延伸反應,一般在2-4小時完成擴増反應,。擴増產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣,。
(4)對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,DNA粗制品及總RNA均可作為擴増模板,。可直接用臨床標本如血液,、體腔液,、洗嗽液、毛發(fā),、細胞,、活PCR技術概論。
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