原代細胞實驗?zāi)康?br />通過細胞融合技術(shù),，初步了解染色體提前凝集標本制備原理,、方法及間期細胞三種時相的提前凝集染色體特點。 
【實驗用品】 
一,、材料 人宮頸癌上皮細胞(HeLa細胞) 
二,、器材和儀器 顯微鏡、離心機,、水浴箱,、熱吹風(fēng)機、10ml刻度離心管,、5(1/2) 針頭注射器,、試管架、染色槽,、廢液缸,、吸水紙、擦鏡紙,、冰凍載玻片,、香柏油瓶、記號筆,、酒精燈,。 
三、試劑 50％PEG,、Hanks液(pH7.4),、RPMI一1640培養(yǎng)基(含10％滅活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素,，0.075mol／L KCl低滲液,、2％檸檬酸鈉溶液、0.2％次甲基蘭染液,、1／15mol／L PBS,、Carnoy固定液、Giemsa染液,。 
【實驗內(nèi)容】 
一,、原理 
如實驗十一所述，兩個或兩個以上的同種或不同種細胞可以在誘導(dǎo)物的作用下融合成一個細胞,。 
七十年代初,，由于發(fā)現(xiàn)M期細胞內(nèi)有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上,，建立了制備染色體提前凝集標本的方法,。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導(dǎo)I期細胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體,。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome,，PCC)。這項技術(shù)已應(yīng)用于細胞周期分析,、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結(jié)構(gòu)的研究,、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復(fù)效應(yīng)的研究，預(yù)測某種血液病的病程,、愈后及復(fù)發(fā)的臨床實踐等方面,。 
二、方法 
1．收集培養(yǎng)的M期HeLa細胞 取一瓶處于對數(shù)生長期的HeLa細胞,，向培養(yǎng)基中加入10μg／ml的秋水仙素使終濃度為0.04μg／ml,，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12小時,，使大量生長的細胞被阻斷于M期,。每組取一瓶經(jīng)上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復(fù)振搖,，使培養(yǎng)液不斷沖涮細胞層(或用吸管吹打),，M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。將含有M期細胞的培養(yǎng)基移入離心管中,，1000rpm離心5分鐘,，棄去上清加人5ml hanks液，用吸管吹打成細胞懸液,。 
2．收集培養(yǎng)的HeLa細胞 取一瓶生長良好的HeLa細胞,，棄去培養(yǎng)基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分鐘,，棄去胰酶消化液,。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成單個懸浮細胞備用,。 
3．50％PEG的制備 
稱取0.5g PEG(MW4,000),，倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化(約為0.5ml),，再加入預(yù)熱的Hanks液0.5ml混勻,，放在37℃水浴中待用。 
4.原代細胞融合 
(1)將上述l,、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻,。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液,。 
(2)用指彈法彈散細胞,，在37℃水浴條件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入離心管內(nèi),，并不斷地輕輕搖動,，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5ml Hanks液以終止PEG的作用,。在37℃水浴甲靜置5分鐘,。 
(3)1000rpm離心5分鐘。棄去上清,，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基,，同時用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液,，37℃水浴中溫育 
30~60分鐘,。 
5．制備PCC標本 
細胞溫育后，1000rpm離心5分鐘棄去上清,，加入10ml 0.075mol／L KCl低滲液輕輕制成懸液,。在37℃處理25分鐘左右；終止時加入lml Carnoy固定液進行固定,，1000rpm離心8分鐘,，去掉上清，指彈離心管底部使細胞分散,，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘,，1000rpm離心5分鐘，棄去上清留0.2ml,，用吸管輕輕吹打成懸液,，取預(yù)冷的載玻片滴一張片，烤干后,，Giemsa染色15分鐘左右,，水沖洗，干燥后鏡檢,。 
三,、結(jié)果觀察 
在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導(dǎo)產(chǎn)生的PCC圖像,，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導(dǎo)產(chǎn)生PCC,，因此有三種不同形態(tài)特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC,。其形態(tài)特點分別是： 
G1期PCC為單線染色體,，細長,，著色淺呈蓬松的線團狀；S期PCC由于染色體解旋,， DNA以多點進行復(fù)制,，復(fù)制后的部分著色較深，以雙線染色體片段形式存在,，故呈粉碎穎粒狀結(jié)構(gòu),；G2期PCC因DNA復(fù)制完畢，所以可見凝集的雙線染色體,，但原代細胞較M期染色體細長,。