人類體細胞染色體標本制備實驗原理和操作步驟

實驗原理 
染色體是在顯微鏡下可見原代細胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結構,。因此，必須獲得染色體標本才能進行檢查分析,，通常情況下,，都是利用外周血淋巴細胞進行核型分析。正常情況下,，人體外周血淋巴細胞不再分裂,，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細胞轉化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力,。因此,，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng),，培養(yǎng)至72小時細胞進入增殖旺盛期,，此時加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞,，經(jīng)低滲,、固定、制片,、染色后鏡下觀察進行核型分析,。

實驗用品 
1．采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶,、超凈工作臺,、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱,、離心機,、刻度離心管、乳頭吸管,、試管架,、量筒、試劑瓶,、載玻片,、吹風機、托盤天平,、顯微鏡,、鏡油、二甲苯,、擦鏡紙,、鑷子、燒杯,、記號筆,、玻片架、火柴,、10ml注射器,。 
2．RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清,、肝素（500 U/ml）,、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）,、KCl低滲液（0.075mol/L）,、甲醇、冰乙酸,、Giemsa原液,、磷酸緩沖液（PH6.8）。 
3．2.5％胰酶溶液（hanks液配制）,、0.4％酚紅,、Giemsa染色液、1N鹽酸,。 

實驗步驟
一．外周血淋巴原代細胞染色體標本制備與分析 
1. 采血及接種培養(yǎng) 
1.1 在酒精燈火焰上,，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml,，使肝素濕潤至管壁。 
1.2 常規(guī)消毒后,，采集外周靜脈血5ml,，轉動注射器使血液與肝素混勻。 
1.3 在超凈工作臺中,，預先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基（5ml,，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中,，再滴加25滴全血（6號針頭）,，水平搖動混勻。 
1.4 置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時,。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物1～2次，使血液均勻懸浮,，再繼續(xù)培養(yǎng),。 
1.5 終止培養(yǎng)前2～4小時，加入秋水仙素,，使終濃度達到0.2μg/ml,。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻,。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時,。 

2．制片 
2.1 收集細胞時，去掉瓶塞,，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液,，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中,。 
2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）,。 
2.3 棄上清液，加入37℃預溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml,，用吸管輕輕吹打細胞團混勻后,，置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。 
2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1）,，用吸管小心吹打,、混勻，1000rpm離心8分鐘,。 
2.5 棄上清液,，加入8ml固定劑，吹打細胞團制成細胞懸液后,，室溫下固定20分鐘,。 
2.6 1000 rpm離心 8分鐘,。 
2.7 棄上清液，重復固定一次,。 
2.8 棄上清液,，根據(jù)細胞數(shù)量的多少適當加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細胞制成懸液,。 
2.9 吸取少量原代細胞懸液,，滴2～3滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散,，氣干,。 
2.10 將標本置Giemsa染液中，染色8分鐘,，水洗去浮色,，氣干。 
2.11 顯微鏡下觀察染色體標本分裂相的多少及分散情況,。