胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒說明書

產(chǎn)品名稱:胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒

英文名稱:Actinobacillus pleuropneumoniaePCR
技術(shù)特點(diǎn)：
1胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒在哪里有賣準(zhǔn)確可靠,，臨床雙盲對(duì)照試驗(yàn)＞1000例，結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)測序法比對(duì),，結(jié)果*性大于99%,。
2高靈敏：可檢測低至10ng的人基因組DNA。
3快速：整個(gè)檢測流程只需3小時(shí),。
4產(chǎn)品僅用于科研簡便：試劑盒提供預(yù)混好的試劑,，使體系配置操作簡便,。
5防污染
6高特異性：雙重特異性組成，保證檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性引物與DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合必需*配對(duì),，才能延伸,。探針特異性與所檢測基因的PCR產(chǎn)物配對(duì)，在延伸中產(chǎn)生熒光,。
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 即開即用,，用戶只需要提供放線桿菌樣品。
2. 根據(jù)伴放線放線桿菌保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物,，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染,。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
組成及試劑配制:
1,、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2,、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為200 U/L,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L,，100 U/L,，50 U/L，25 U/L,，12.5 U/L,，6.25 U/L，3.12 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5,、 檢測稀釋液B：1×10ml,。

胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞,、血液,、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求,，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況,；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種,、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào),；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰,，也可以保存于Trizol液中,。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類,，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA,、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對(duì)定量）和定性分析,。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達(dá)差異分析,、基因分型,。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取,、cDNA合成,、qPCR。

胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右,。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。

⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗,。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn),， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處,。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),。