猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項

  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。
  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。
  預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取50μL加樣即可,。
  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作,。
  所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

12孔×8條

12孔×4條

無

標準品（6管）

0.5ml/管

0.5mL/管

無

樣本稀釋液

6mL

3mL

無

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

無

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測試劑盒按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

無

底物B

6mL

3mL

無

終止液

6mL

3mL

無

封板膜

2張

2張

無

說明書

1份

1份

無

自封袋

1個

1個

無

注：

1、標準品濃度依次為：8,、4,、2、1,、0.5,、0.25 ng/mL.

2、在樣本值超過標準品zui高濃度的情況下,，可用樣本稀釋液適當稀釋樣本,。

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。
  自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。
操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設(shè)置標準品孔,、樣本孔和空白孔,，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
  待測樣本孔各加待測樣本50μL,；
  隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
  所有孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
  所有孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中,，以標準品濃度作橫坐標,，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值,。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900,。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL,。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。

6.  猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測試劑盒有效期：6個月