猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)

  試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。
  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。
  預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取50μL加樣即可,。
  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。
  所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標(biāo)板

12孔×8條

12孔×4條

無

標(biāo)準(zhǔn)品（6管）

0.5ml/管

0.5mL/管

無

樣本稀釋液

6mL

3mL

無

檢測(cè)抗體-HRP

10mL

5mL

無

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測(cè)試劑盒按說明書進(jìn)行稀釋

底物A

6mL

3mL

無

底物B

6mL

3mL

無

終止液

6mL

3mL

無

封板膜

2張

2張

無

說明書

1份

1份

無

自封袋

1個(gè)

1個(gè)

無

注：

1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：8,、4,、2、1,、0.5,、0.25 ng/mL.

2、在樣本值超過標(biāo)準(zhǔn)品zui高濃度的情況下,，可用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋樣本,。

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。
  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。
操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加,；標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
  待測(cè)樣本孔各加待測(cè)樣本50μL；
  隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,，,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
  棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
  所有孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
  所有孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值,。
結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900,。

2.  靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

4.  重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。

6.  猴狂犬病毒抗原（PRV-Ag）ELISA檢測(cè)試劑盒有效期：6個(gè)月