(一)溫度

一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37℃～38℃。溫度過高或過低都會影響到細(xì)胞的生長,。細(xì)胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強，在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低,。溫度不低于O℃時，雖影響細(xì)胞代謝,，但并無傷害作用,；把細(xì)胞置于2s℃～35℃時，細(xì)胞仍能生存和生長,，但速度減緩,；放在40℃數(shù)小時后，再置回37℃培養(yǎng)細(xì)胞仍能繼續(xù)生長,。但如果在40℃下暴露時間太長,，對細(xì)胞生長不利，甚至變圓脫落于瓶壁,。若溫度過低,，在降到冰點以下時，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡,。但若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲亞砜等保護劑,，封入安瓿中后，置于液氮中,，可起保護作用,，此時細(xì)胞可耐受一70℃以下溫度，能長期儲存,，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇,，仍能繼續(xù)生長增殖，細(xì)胞生物性狀不受任何影響,。此為保存細(xì)胞的主要手段,。

高溫對細(xì)胞培養(yǎng)不利。細(xì)胞在39℃～40℃培養(yǎng)1小時,，能受到一定損傷,，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2℃,，持續(xù)數(shù)小時,，即在41℃～42℃中培養(yǎng)l小時，細(xì)胞損傷
嚴(yán)重,，溫度至43℃以上時細(xì)胞多數(shù)被殺死,。高溫主要引起酶的滅活,、類脂質(zhì)破壞，核分裂的破壞,，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固,，另外使蛋白質(zhì)變性。因此,，體外培養(yǎng)細(xì)胞時一定要避免高溫,。

(二)滲透壓

細(xì)胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發(fā)生皺縮或腫脹,、破裂,。所以，滲透壓是體外培養(yǎng)細(xì)胞的重要條件之一,。哺乳動物和其他動物組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與Nacl有關(guān),，但不能忽視其他電介質(zhì)滲透壓的關(guān)系。滲透壓與單位體積溶媒內(nèi)溶質(zhì)的分子數(shù)和離子數(shù)成正比,。為此,，按一定比例控制培養(yǎng)液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的,。

這不僅是為了維持細(xì)胞張力,，而且是為了調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝。因為細(xì)胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養(yǎng)物質(zhì)的輸送(如氨基酸,、蔗糖等),，直接影響細(xì)胞基本合成系統(tǒng)。

理想的滲透壓因細(xì)胞的類型及種族而異,，人血漿滲透壓為290nlmol／L,，被視為是體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。哺乳類動物細(xì)胞的滲透壓一般為290～300mmol／L,。人胚肺成纖維細(xì)胞為250～325nlmol／L,，鼠則為3。10mmol／L左右,。在實際應(yīng)用中,，260～320mmol／L的滲透壓可適于大多數(shù)細(xì)胞。

(三)氣體環(huán)境和pH

體外培養(yǎng)細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境,，氧和二氧化碳是細(xì)胞生存必須的條件之一。氧參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán),，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長,、增殖和合成各種所需成分。有些細(xì)胞在低氧條件下,，可借糖酵解取得能量,，但多數(shù)細(xì)胞低氧時不能生存,。氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細(xì)胞有害,。采用開放式培養(yǎng)時(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)),，一般要把細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。

 C02是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物．又是細(xì)胞生長所必需的成分．并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān),。在密閉瓶中C02濃度偏低的情況下,，細(xì)胞容易生長；一般不能低于l％,，否則有損細(xì)胞,。

C02增加將使pH下降。大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7．2～7．4條件下生長,，低于pH6．8或高于pH7．6對細(xì)胞有害,，甚至退變或死亡。各種細(xì)胞對pH的要求不盡相同,。一般原代培養(yǎng)細(xì)胞對pH的變動耐受性差,，永生性細(xì)胞系和惡性細(xì)胞對pH的變動耐力強。但總的來說,，細(xì)胞對堿性不如對酸性的變化耐受,，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細(xì)胞生長有利。細(xì)胞在生長過程中隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強,，不斷釋放C02,，使培養(yǎng)基變酸，pH發(fā)生變化,。所以．為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH,，多采用在培養(yǎng)液中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法。磷酸緩沖劑中的NaHC03可供給CQ,，但C02易于逸出．故只適用于封閉式培養(yǎng),。

  (四)無毒和無茵

無毒和無菌是體外培養(yǎng)細(xì)胞的首要環(huán)境條件。細(xì)胞在活體內(nèi),，偶爾有細(xì)菌或有害物質(zhì)入侵,，因體內(nèi)有強大的解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，可將其解毒或清除,，而不易受損害,。但在離體的環(huán)境中，失去了防御系統(tǒng),，一旦有害物質(zhì)入侵或細(xì)菌污染,，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，前功盡棄,。如培養(yǎng)瓶皿,、支持物,、培養(yǎng)基、瓶蓋,、瓶塞上若有細(xì)胞毒性,，在培養(yǎng)過程中可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,，在選用這些器皿,、材料時要注意，若這些物品消毒不*,，帶菌或操作過程不小心使細(xì)胞污染．也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡,。若出現(xiàn)交叉污染．可使實驗室原來的細(xì)胞系失去原有特性，應(yīng)引起足夠的重視,。

(五)輻射線和超聲波

1．可見光可見光的波長是390～780nim,。可見光的各種有色光能引起細(xì)胞蛻變,，延長核分裂的問期,，還可顯著降低細(xì)胞的附壁能力。因此．體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)避免目光直接照射,，在黑暗中進行培養(yǎng)或短期存放,。

2．紫外線弱紫外線下耐受能力強的細(xì)胞變化不大，但對敏感的細(xì)胞有損害,。紫外線強時,，新分離的細(xì)胞顯示：不能進行*的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮,；在有絲分裂時細(xì)胞質(zhì)的起泡減少,。E1rlich腹水癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后，用飛點紫外線顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡,，隨后細(xì)胞膨脹,，損害也漸變嚴(yán)重。

3．放射線x射線對細(xì)胞有明顯損傷,。0射線可影響細(xì)胞核的分裂,。7射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂，可使細(xì)胞死亡,。

4．超聲波和振動在超聲波振動下,，細(xì)胞很快會破裂，開始是胞質(zhì)發(fā)生紊亂的流動,，原生質(zhì)膠體結(jié)核也有明顯變化,，若停止超聲波振動可回復(fù)。細(xì)胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致。當(dāng)超聲波在2．5W／cm,。時，細(xì)胞受損,，染色體發(fā)生畸變,，首先發(fā)生畸變的是核染色體。

(六)細(xì)胞接種濃度(密度)

在體外培養(yǎng)細(xì)胞中,，細(xì)胞接種數(shù)對細(xì)胞的生長有影響,，適宜的接種密度，可以促使細(xì)胞增殖,，接種密度太低或太高都不利于細(xì)胞的生長增殖,。如果培養(yǎng)液與細(xì)胞的容積比例大于2000：l，生長物質(zhì)彌散到細(xì)胞外的比例將是細(xì)胞內(nèi)達(dá)到低于zui小限度的濃度,，此時細(xì)胞不能再增殖,，培養(yǎng)液中的pH變堿，抑制細(xì)胞生長,，細(xì)胞變圓不能貼壁,，甚至引起細(xì)胞死亡等。如果接種密度太高,，每個細(xì)胞周圍培養(yǎng)液的容積降至O．007nnm,。以下，由于彌散率的降低,，細(xì)胞內(nèi)生物質(zhì)的濃度增加,，容易使排除物或其他代謝產(chǎn)物達(dá)到飽和，能量來源也很快耗盡,，因此也會妨礙細(xì)胞的增殖,。

如何選擇適宜的接種濃度要根據(jù)細(xì)胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定。一般來說,，細(xì)胞代謝旺盛,、生長速度快的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞，接種濃度宜偏低,；而正常組織細(xì)胞生長較慢,，代謝不夠旺盛，接種濃度可偏高,；如果是為了保種或不需急用,，接種濃度可偏低些；有時為了便于觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),，接種濃度也可適當(dāng)降低,。

(七)容器轉(zhuǎn)動速度和懸浮攪動速度

有時為了研究的需要而將培養(yǎng)細(xì)胞在容器中進行旋轉(zhuǎn)或攪動，如貼壁細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)管中培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)鼓的轉(zhuǎn)速提高,，細(xì)胞增殖率隨之提高,。其原因可能是轉(zhuǎn)動使足夠的營養(yǎng)流動和較充分的氧化作用之故。

當(dāng)懸浮攪拌培養(yǎng)細(xì)胞時,，攪拌速度既不能太快,，也不能太慢。如太慢,，細(xì)胞易結(jié)團,、下沉和貼壁，不利于細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下增殖,。如果太快,，容易起泡沫，細(xì)胞易窒息致死,，同時,，強烈地攪動易使細(xì)胞因機械損傷而破裂。所以選擇適宜的攪拌速度很重要,。如BH21的攪拌速度適宜為460～330r／min,；淋巴細(xì)胞(Raji)株，在200r／mln和400r／mln時細(xì)胞數(shù)不增不減,，或稍有下降,，而攪拌速度增加到600r／mi時出現(xiàn)生長；類淋巴細(xì)胞(Namal—va)生長速度快,，在80～100r／min時既不結(jié)團,，又不需加抗泡沫劑，且細(xì)胞生長仍然很快,。