細(xì)胞凍存

1、取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化,，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來,。800r/min離心5min，棄上清收集細(xì)胞,。如果是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,，可直接離心收集細(xì)胞。

2,、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基,，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大,，3*106個/ml左右,，并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3,、細(xì)胞懸液裝入凍存管中,。用膠布封裹，做好標(biāo)記(注明細(xì)胞種類,、時間,、條件等),。

4、凍存管在4℃下存放30min,，轉(zhuǎn)放-20℃1.5h~2h,，再轉(zhuǎn)入-70℃4~12h后即可轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)(-196℃)，注意進(jìn)行登記,。

細(xì)胞復(fù)蘇

1,、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2,、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍,。

3、取出凍存管,，用75%酒精清潔管口,，打開。

4,、離心去上清收集細(xì)胞,，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基,，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。

5、每日觀察細(xì)胞生長情況,，如果死細(xì)胞較多,，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

注意事項

1,、在使用含有DMSO的凍存液時，因為DMSO在室溫狀態(tài)易損傷細(xì)胞,，所以在細(xì)胞加入凍存液后應(yīng)盡快放入4℃環(huán)境中。

2,、準(zhǔn)確記錄細(xì)胞的種類,、凍存時間、凍存液的品種和凍存者信息,。