全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血,，不易采用肝素鋰,、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析,，超過8小時會導致活性的損失,，一般細胞因子陽性細胞會減少5%,。如不能在8小時之內(nèi)檢測,，應將真空采血管水平室溫放置。
 
自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后,，分離PBMCs,，24小時內(nèi)分析。
 
組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs,，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,，調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106細胞/ml。
 
調(diào)節(jié)細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中,。
 
冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs,，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸,，-70℃凍存,。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液,，離心5分鐘后,，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。
 
所需試劑
 
1,、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑
 
依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標志
 
CD45圈定所有淋巴細胞
 
CD3 圈定T淋巴細胞
 
CD4 圈定T輔助淋巴細胞亞群
 
CD8 圈定T抑制淋巴細胞亞群
 
CD19/或CD20圈定B淋巴細胞
 
CD56圈定NK淋巴細胞
 
CD14圈定單核細胞
 
2,、熒光標記的細胞因子抗體
 
R&D提供FITC、PE和APC標記的細胞因子抗體
 
3,、溶血素
 
用外周全血檢測時需使用溶血素(R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠;eBioscience目錄號00-4333)溶解紅細胞
 
4,、激活劑
 
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Alexis，目錄號ALX-445-004-M001)
 
DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL
 
分裝(20?L)，-20℃儲存,。勿反復凍融
 
每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液
 
D.PMA終濃度25ng/mL細胞懸液
 
② Ionomycin (Alexis,，目錄號ALX-450-006-M001)
 
于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
 
-20℃儲存
 
每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
 
③Ionomycin終濃度1?g/mL細胞懸液
 
Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma，Catalog No.S-4881)
 
無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL
 
4℃儲存
 
SEB終濃度10?g/mL細胞懸液
 
④ CD3：包被在培養(yǎng)板中,，在蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞
 
⑤ CD28：加速不同刺激劑(包括SEB,、CD3等)的活化效應，濃度一般為10ug/ml
 
5,、阻斷劑
 
阻斷高爾基體介導的轉(zhuǎn)運作用,，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)
 
① Brefeldin-A(BFA) (eBioscience，目錄號00-4506)
 
于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
 
分裝(20L),，-20℃儲存,。勿反復凍融。
 
每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
 
激活zui后4-5小時BFA終濃度10?g/mL細胞懸液,。
 
注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降
 
② Monensin (eBioscience,，目錄號00-4505)
 
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640