單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Single immunodiffusion test)—人血清中IgG,、IgA,、IgM的測定,。
單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種定量試驗(yàn)，將抗體混合于瓊脂內(nèi),，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔,，再將抗原標(biāo)本加入孔內(nèi),，經(jīng)過一定的時間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán),，環(huán)的大小與抗原含量和擴(kuò)散時間相關(guān),。用不同濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從準(zhǔn)標(biāo)曲線中求出,。本試驗(yàn)主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補(bǔ)體成份的含量,。
材料
IgG、IgA,、IgM免疫板,、參考血清,、待檢血清、微量加樣器(10微升),、量尺,、紗布、生理鹽水,、帶蓋方盤,。
方法
1、免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂(用PH8.2,、0.05M的巴比妥緩沖液配成),，加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清(抗血清zui終稀釋度取決于抗血清所標(biāo)化的稀釋度),，混勻,，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔,，孔徑為3mm,，孔距1～1.2cm。
2,、稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用,，參考血清、待檢血清稀釋按要求進(jìn)行,。
3,、加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應(yīng)的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清,，每個檢樣加兩個孔,，每孔滴加10微升。
4,、擴(kuò)散：將免疫板置水平濕盤內(nèi),，放進(jìn)37℃溫箱，IgG免疫板擴(kuò)散24小時,，IgA,、IgM板48小時后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，(如果沉淀環(huán)不清晰,，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時后觀察),，必要時可以染色后觀察。
5,、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及血清標(biāo)本中IgG,、IgA、IgM定量測定：測量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān),，還與分子量和擴(kuò)散時間有關(guān),。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系,，這種關(guān)系有兩種計(jì)算方法：
(1)Mancini曲線-適用于大分子抗原和長時間擴(kuò)散(>48小時)的結(jié)果處理,。使用方格計(jì)算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系,。公式表示：C/d2 =K(C=抗原濃度,，d=沉淀環(huán)直徑，K=常數(shù)),。
(2)Fehey曲線-適用于小分子抗原和較短時間(24小時)擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線,，濃度的對數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系,。公式表示：logC/d=K(C=抗原濃度，d=沉淀環(huán)直徑,，K=常數(shù)),。
結(jié)果：免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批號的參考血清其免疫球蛋白含量不一,。