1,、原理：

(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù),。

(2)血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers,，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格,，深度均為0.1mm,。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml,。使用時(shí),，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù),，再乘以104,，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目,。

(3)存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色,，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料,，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%,。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力,，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確,。

2,、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計(jì)數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液(4%乙酸溶液),。

3,、步驟：

(1)取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

(2)取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片,，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色,，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish),。

(3)計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4,，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,，因與trypanblue等體積混合)，zui后乘以104,，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù),。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞),。

注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),，zui適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大,。高濃度細(xì)胞懸液,，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。

4,、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液,，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55,，62，49,，59;死細(xì)胞數(shù)/方格：5,，3，4,，6;細(xì)胞總數(shù)=243

平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75;稀釋倍數(shù)=2;

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75×104×2(稀釋倍數(shù))=1.22×106;

細(xì)胞數(shù)/flask(10ml)：1.22×106×10ml=12.2×106

其實(shí)理論上講處于細(xì)胞增殖期之前的細(xì)胞都可用于凍存,，不過如果想要更好的效果，是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，并注意做好凍存前的換液工作,。溫馨提示，從凍存管將細(xì)胞放入或取出時(shí),，都好做好保護(hù)工作,，以免受凍。