細(xì)胞融合的方法有物理法，如電融合,、激光融合,，化學(xué)融合法和生物融合法，如仙臺病毒,，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法,。

聚乙二醇(PEG)，在分子量為200～700時,，呈無色,、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1 000時,，呈乳白色蠟狀固體,，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑,，對熱穩(wěn)定,，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者,，常用濃度為50%,，pH8.0～pH8.2(用10%NaHCO3調(diào)整)，分子量小的PEG，融合效應(yīng)差,，又有毒性,，分子量過大，則粘性太大,，不易操作,。50%濃度，pH偏堿時融合效應(yīng)zui高,。

也有采用30%～50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜,。

不同批號的PEG，即使分子量相同,，但融合率卻有明顯差異,，選用時必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗后方可應(yīng)用,。要買高純度的,，一般選供氣相色譜用的PEG。

)融合過程

融合的方法很多,，常用的有轉(zhuǎn)動法和離心法,。

融合時脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1zui為常用,。

1.試劑與材料

(1) 供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞,。

(2) 1640培養(yǎng)液100ml。

(3) *1640液100ml,。

(4) 2.5%FCS-1640液50ml,。

(5) HAT培養(yǎng)液100ml。

(6) 50%PEG：取分子量4 000,，高純度的(日本進(jìn)口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,，使用前用預(yù)熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚紅檢查pH,，一般不必調(diào)pH,。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調(diào)整,。

(7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶,。

(8) 40孔塑料培養(yǎng)盤。

2.操作方法

⑴ 準(zhǔn)備好脾細(xì)胞,。

⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞,，并加入50ml 2.5%FCS-1640液。

⑶ 室溫400g離心3min,，使細(xì)胞沉淀,。

⑷ 移去上清液,。

⑸ 輕敲管底部，使沉淀流動,，把沉淀管放于40℃水浴中,，使其達(dá)融合溫度。

⑹ 加預(yù)熱至40℃的50%PEG 0.8ml,，用1ml吸管緩慢滴加,，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn),，滴加過程要求持續(xù)2min,。

⑺ 加1ml1640液，邊加邊搖動,，持續(xù)1min,。

⑻重復(fù)⑺一次。

⑼ 加1ml 1640液,，邊加邊搖動,，持續(xù)0.5min,。

⑽ 重復(fù)⑼一次,。

⑾ 加1640液15ml。

⑿ 室溫,，400g離心1min,，使細(xì)胞沉淀。

⒀去上清,，輕敲管底部,，加25ml含有HAT的*1640液。

⒁ 往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細(xì)胞液,，每孔1滴(約0.05ml),。

⒂ 輕搖后，放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育,。

⒃ 第3,、6、9,、10日換入含HAT的*1640培養(yǎng)液,。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出,，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞,。

⒄ 于第12、15日加入含有HAT的*1640培養(yǎng)液,。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長出來,。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的,。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后,，吸取上清液，檢查抗體,。

⒅ 對繼續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代,。在傳代過程中，依情況取消HAT液和*1640液而代之以10%FCS-1640液,。同時保存于液氮和進(jìn)行克隆化,，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失,。

細(xì)胞融合的關(guān)鍵

1.技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗,。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答,。這必然要失敗的,。

2.融合試驗zui大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個干凈的環(huán)境,，以及適宜的無菌操作技術(shù),。