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細(xì)胞瓊脂克隆斑形成實驗方法
1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液, 使用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后備用,。
2.使用梯度稀釋法適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸液后, 向6孔板的每個孔內(nèi)分別加入含50 個細(xì)胞的2 mL細(xì)胞懸液, 細(xì)胞懸液使用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液配制,。每種細(xì)胞均設(shè)置3個6孔板復(fù)孔,。
3.12 h后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)全部貼壁, 此時將皿中培養(yǎng)液換成瓊脂濃度為0.2%的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液, 置于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。
4.10 d后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)出現(xiàn)集落生長的細(xì)胞克隆斑,。此時棄去含瓊脂的培養(yǎng)液, 用PBS 輕輕潤洗2次, 然后6孔板內(nèi)每孔加入2 mL冰甲醇固定30 min, 固定結(jié)束后使用PBS輕輕潤洗2次, 然后使用結(jié)晶紫染色5 min, 再用PBS輕輕潤洗后室溫干燥,。
5.干燥完成后將6孔板移至顯微鏡下觀察計數(shù)每個孔內(nèi)細(xì)胞克隆斑數(shù)量, 超過50個細(xì)胞的克隆斑即可計數(shù),。根據(jù)細(xì)胞克隆斑形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%來計算細(xì)胞體外克隆率。
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