腎透明細胞腺癌細胞,；769-P操作步驟:

1,、貼壁細胞的消化

①吸除培養(yǎng)液，用無菌 PBS,、Hanks 液或無血清培養(yǎng)液洗滌細胞一次,，以去除殘余的血清。

②加入少量生物 Trypsin-EDTA solution,，略蓋過細胞即可,，室溫放置 0.5～2min， 不同的細胞消化時間有所不同,。

③顯微鏡下觀察,，細胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變

化,；或者用槍吹打細胞發(fā)現(xiàn)細胞剛好可以被吹打下來,，吸除細胞消化液。加入含血清的  *細胞培養(yǎng)液,，吹打下細胞,，即可直接用于后續(xù)實驗。

④如果發(fā)現(xiàn)消化不足,，則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化,。

⑤如果發(fā)現(xiàn)細胞消化時間過長，未及吹打細胞,，細胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,， 直接用細胞培養(yǎng)液把細胞全部吹打下來。1000～2000g 離心 1min,，沉淀細胞,，盡量去除細胞消化液后，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細胞,，即可用于后續(xù)實驗。

2,、組織的消化不同的組織需要消化的時間相差很大,，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

免疫熒光鑒定：

1,、待心房肌細胞生長至80%融合時,，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次,，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次,，每次10min,，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min,；

3,、PBS沖洗細胞2次，每次10min,，然后在室溫條件下,，用4% BSA封閉細胞30min；

4,、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5,、PBS沖洗細胞3次,，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗,， 37℃條件下放置1h,；

6、用PBS沖洗3次,，每次10min,，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。