磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器

或研缽勻漿,。

2,、 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

3,、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

4,、 上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的 α-KGDH（此步可選做）。

5,、 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或

200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體 α-KGDH 活性測定,。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 樣本測定

（1）在試劑五中加入 18mL 試劑四充分溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）

水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用,；

（2）在試劑六中加入 1mL 蒸餾水,，充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用,；

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本,、10μL 試劑六和 180μL 試劑五，混

勻,，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,，計算 ΔA=A2-A1。

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