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副結核分支桿菌PCR檢測試劑盒反應五要素

時間:2021/3/30閱讀:284
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副結核分支桿菌PCR檢測試劑盒反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,,常用為20bp左右,。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機分布,,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現(xiàn)二級結構,,避免兩條引物間互補,,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,,產生非特異的擴增條帶,。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,,應嚴格要求配對,,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點,, 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,,以低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,,且可增加引物之間形成二聚體的機會,。

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