犬腺病毒PCR檢測試劑盒反應(yīng)流程常規(guī)程序：

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后,，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘,，使模板DNA充分變性,，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán),。在每一個循環(huán)中,，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間）,，一般保持30秒鐘,，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴(kuò)增1kb片段）,，使引物在模板上延伸,，合成DNA，完成一個循環(huán),。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次,，使擴(kuò)增的DNA段大量累積。后,，在72℃保持3-7min,，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存,。

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素,，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定,。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃,。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度,，變成二步法PCR,。

3．反應(yīng)時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘,，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板,，變性時(shí)間可適當(dāng)延長,。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的,。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定,，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時(shí),，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象,。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低,，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用,，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*,。

5．PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會影響反應(yīng)的正常進(jìn)行,。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在后加入DNA聚合酶,。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā),。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí),，有時(shí)會擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時(shí),，如果將反應(yīng)成分分開配制,，A管含模板、引物和dNTP,，以及調(diào)整體積的H2O,，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,，然后再將兩管溶液混合起來,，可較好地克服這個問題。

按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系,，有時(shí)會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問題,。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP,、緩沖液,，Mg2+和primer先配制好,，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化,，再冷卻,，使蠟將溶液封住，后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分,。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入高溫階段后,，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會混合在一起,。