轉(zhuǎn)化細胞實驗試劑
1. 細胞營養(yǎng)液（DMEM液體培養(yǎng)基,，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml）,，消化液（0.05％胰酶,，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液,。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO4·2H2O, 12mM葡萄糖，50mMHepes,，pH7.05, 0.2μ過濾除菌）,，CaCl2（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液,，超純水（滅菌）,。
3. PBS，蛋白酶K,，NP40,，RNaseA，無水乙醇,，酚,，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖,，TAE電泳緩沖液,，EB。
實驗設(shè)備
1. 10cm細胞培養(yǎng)皿
2. 50ml,、15ml一次性離心管
3. 10ml玻璃吸管（滅菌）,，與玻璃吸管配套的吸球及膠管
4. 二氧化碳培養(yǎng)箱
5. 倒置顯微鏡
6. 20μl，200μl微量移液器
7. 1.5ml離心管（滅菌）
8. 200μl微量移液器頭
9. 1ml微量移液器
10. 低速臺式離心機
11. 高速臺式離心機
12. 4°C,，－20°C冰箱
13. DNA凝膠電泳設(shè)備
14. 紫外凝膠成像儀
實驗材料
胚腎細胞系293,，TNF－R1哺乳動物細胞表達質(zhì)粒（CsCl超速離心純），哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）,。
實驗步驟
1. 293細胞的傳代培養(yǎng)（*天） 
   1） 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài),，確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度,，因此應(yīng)根據(jù)母細胞的生長密度調(diào)整傳代比例,。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可,。 
   2） 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋,，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液，加入2mlHank’s液,，輕輕搖動,，將溶液倒出。 
   3） 消化與分裝,。 
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液）,，37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察,，如果細胞變圓且彼此分離表明消化*,，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次,，使培養(yǎng)皿壁上的細胞全部脫落下來,，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當(dāng)體積的營養(yǎng)液,，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中,。 
在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。 
2. 用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天） 
   1） 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細胞的生長狀態(tài) 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2） 轉(zhuǎn)染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體,，對照組為空載體），350μl超純水,，40μlCaCl2（2.5M）溶液,，混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS,，將A液分三次緩慢加入,，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘,。 
      c. 將A,，B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動使混勻,。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中,。 
3. 轉(zhuǎn)化細胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1） 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態(tài)上的差異,。 
   2） 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來,，收集到15ml離心管中,，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸,，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,，2000rpm離心3分鐘，去除上清液,，加入200μlPBS（0.2mg/ml 蛋白酶 K）,，重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40）,，顛倒混勻,，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次,。12,000rpm離心2分鐘,，吸出上清，加入1ml乙醇,，顛倒混勻,，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘,，沉淀溶于50μl水中,，加入RNaseA（10mg/ml），37°C靜置20分鐘,。 
   3） 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液,，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳,，紫外凝膠成像儀拍照,。
含量測定    100mg    130568-200501    莫匹羅星
含量測定    100mg    130569-200601    替卡西林
紅外鑒別    100mg    130570-200501    磷霉素鈉
含量測定    200mg    130572-200701    頭孢西丁
鑒別    50mg    130573-200701    1,3－萘二酚
有關(guān)物質(zhì)    50mg    130576-200901    克林霉素B
有關(guān)物質(zhì)    100mg    130579-200901    反式頭孢吡肟
HPLC含量    100mg    130585-201001    巴洛沙星
有關(guān)物質(zhì)    50mg    130601-201001    環(huán)丙沙星雜質(zhì)B
有關(guān)物質(zhì)    50mg    130605-201001    環(huán)丙沙星雜質(zhì)Ⅰ
有關(guān)物質(zhì)    50mg    130650-200901    阿奇霉素雜質(zhì)J
轉(zhuǎn)化細胞