轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />動(dòng)物的游離細(xì)胞以及植物成微生物去壁后的原生質(zhì)體,，在電刺激下進(jìn)行細(xì)胞融合，且融合率高,、無(wú)毒性,，操作簡(jiǎn)便及融合后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)成活率高等優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞工程手段的又一進(jìn)展,。
實(shí)驗(yàn)原理
將制備的游離細(xì)胞或原生質(zhì)體,，置于電融合室中，在高頻交流電場(chǎng)的作用下,，細(xì)胞被極化,，成為偶極子，造成細(xì)胞之間相互連接,，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過(guò)高或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，則細(xì)胞連接成串珠狀，應(yīng)適當(dāng)控制以上條件,，盡量使兩細(xì)胞處于點(diǎn)接觸狀態(tài),，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用,，可擊破兩細(xì)胞接觸點(diǎn)部位的質(zhì)膜,，此時(shí)質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時(shí)由于細(xì)胞表面的張力作用,，使兩細(xì)胞融合逐步*,。
實(shí)驗(yàn)用品
一,、儀器
JCF-I型細(xì)胞電融合儀,、細(xì)胞融合池、普通離心機(jī),、倒置顯微鏡(或研究用顯微鏡),，刻度吸管、不銹鋼網(wǎng)(200目),、鑷子,、解剖刀,、解剖剪、注射器,、毛細(xì)吸智,、刻度吸蕾。小燒杯(10m1),、滴瓶,、培養(yǎng)皿、毛筆等,。
二,、藥品
甘露醇、氧化鈉,，纖罐索醇(Onozura R-10),、離析酶(Macerozyme R-10)、蝸牛酶(中科院生物物理所產(chǎn)),、CaCl2,、2H2O、MES (2-N-嗎啉乙烷磺酸),、葡聚糖硫酸鉀等,。
實(shí)驗(yàn)方法
本實(shí)驗(yàn)所有步驟均可在有菌條件下操作。
一,、植物原生質(zhì)體的制備
1,、取幼嫩的葉片或充分展開(kāi)的子葉，先用水洗凈并吸去表面的水份,，再置入小燒杯中將葉片剪成碎塊,。
2、將碎塊放入1.5％纖維素酶,、0.3％離析酶,、0.5％蝸牛酶、0.6mol/L甘露醇,、50mmol/L CaCl2·2H20,、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸鉀0.3％,，pH5.6的酶液中,，置于25℃暗處游離5h(或15℃過(guò)液)，游離時(shí)間結(jié)束時(shí),，可鏡檢原生質(zhì)體分離情況，如果大多數(shù)原生質(zhì)體還未從組織中釋放出來(lái),，需增加在酶液中的游離  時(shí)間,。新出廠的酵在5h內(nèi)一般就可將原生質(zhì)體游離出來(lái),，但因藥品質(zhì)量問(wèn)題或存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，致使酶活力下降,，要適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間,。
3、將醇解出來(lái)的原生質(zhì)體用不銹鑰網(wǎng)過(guò)濾,，以除去未被酶解的組織,，過(guò)濾后用0.6M的蔗糖沖洗網(wǎng)上殘留的原生質(zhì)體，然后以200r/min進(jìn)行離心處理5min,。
4,、用帶長(zhǎng)針頭的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O,，將原生質(zhì)體混勻,。
5、用細(xì)頭滴管或帶長(zhǎng)針頭的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液,，再以300r/min離心10min,，此時(shí)可見(jiàn)到在上下兩液體間的界面處有一層乳白質(zhì)的帶狀物，即為純凈的原生質(zhì)體,，其破碎的部份及其它雜質(zhì)都沉降到離心管底部,，用長(zhǎng)針頭注射器或毛細(xì)吸臂分別吸去管底的雜質(zhì)和蔗蔗糖液以及原生質(zhì)體上層的  CaCl2液。
6,、向離心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液,，混勻后以300r/min離心5min去掉上清液，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀釋并調(diào)整每毫升含5×104個(gè)原生質(zhì)體,。
二,、動(dòng)物細(xì)胞的制備
用滅菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸鈉0.88,，NaCl0.42g,，加重蒸水至100ml）lml，再?gòu)碾u的翼下靜脈取血0.5--1ml,，取出后放入刻度離心管中,，再加入2--3ml Alsver液，使總量為4--5ml,，混勻并封口,，置于4℃冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用，實(shí)驗(yàn)時(shí)取貯備的雞血細(xì)胞lml,，加入4ml85％生理鹽水,，混勻后以1200rr/min離心5min，去上清液后,，zui后用0.6mol/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混勻后以上述離心條件洗滌兩次,，zui后用0.6mol/L的甘露醇液將雞細(xì)胞稀釋并調(diào)整成每毫升含2×105個(gè),。
如采用傳代培養(yǎng)的骨髓或腹水瘤細(xì)胞，可先用0.9％的生理鹽水洗滌兩次,，離心速度為800--1000r/min,，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗滌兩次,，每次600--800r/min,，離心5min，zui后用甘露醇調(diào)整成每毫升含瘤細(xì)胞1×105個(gè),。
三,、細(xì)胞電融合方法
1、儀2S結(jié)構(gòu)和使用方法
JCF-型細(xì)胞電融事儀的各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)是通過(guò)大量的融合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),，并參考島津公司(日)SSH型電融合裝置的參數(shù)值而設(shè)計(jì)的．當(dāng)打開(kāi)電源,，指示燈亮，并撥通輸出開(kāi)關(guān)和正弦輸出開(kāi)關(guān),，選擇和按下正弦頻率按鍵(共分為0.6,、0.8、1.3,、1.5MHz五檔),，此時(shí)將輸出電纜與示波器相接，在示波器上即出現(xiàn)高頻正弦波形,，當(dāng)左右旋轉(zhuǎn)正弦幅度旋鈕,，則正弦電壓的p-p值，也隨之降低和升高,，如果將輸出電纜與電融合室相接,，則細(xì)胸相互連接．此時(shí)再旋動(dòng)正弦幅度(即正弦電壓)旋扭，則儀器上電壓表指針隨之升高和降低．如果正弦電壓過(guò)高,，則細(xì)胞連接速度加快,，并呈串珠狀，不利于兩細(xì)胞融合,。
將正弦輸出開(kāi)關(guān)搬至“復(fù)合輸出”檔,，根據(jù)所需功率大小選拔復(fù)合輸出I或、II檔,、I檔為低功率,，II檔為高功率；再根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,，選擇并按下你所需要的“脈沖寬度”撥鍵(分1ms,，0.2ms、0.1ms、10ms,、1us五檔)和“脈沖幅度”按鍵(50V,、100V,、150V,、200V、250V五檔),，還配有脈沖幅度旋扭(細(xì)調(diào)),，調(diào)整范圍0-50V，可使每檔增值50V,。
施加脈沖刺激可分為“自控”和“手控”兩檔,，當(dāng)使用“自控”輸出脈沖時(shí)，先將開(kāi)關(guān)搬向自控檔,，然后根據(jù)需要選擇并按下“脈沖頻率按健”(分為2sl次及每秒1次,、2次、5次,、l0次共五檔),，即可自動(dòng)發(fā)送電脈沖；如果將開(kāi)關(guān)搬至“手控”檔,，需按動(dòng)“手控”按扭,，每按動(dòng)一次發(fā)送一個(gè)脈沖。無(wú)論自控或手控輸出,，每個(gè)脈沖輸出都伴有報(bào)鳴音響,，將輸出端與脈沖示波器連接，則可觀察到由脈沖寬度,、幅度及脈沖間隔所構(gòu)成的示波圖像,，當(dāng)改變以上有關(guān)參數(shù)值時(shí)，其圖像亦發(fā)生變化：把開(kāi)關(guān)搬向反向,，則產(chǎn)生負(fù)脈沖,，當(dāng)脈寬和幅度等值不變時(shí)，其圖像與正脈沖波形相同,，但方面相反,，上下對(duì)稱．將電纜輸出端與電融合室的兩電極相接，并按上述要求發(fā)送一定方波脈沖,，細(xì)胞受到電刺激后,，可產(chǎn)生融合。
2,、轉(zhuǎn)化細(xì)胞電融合操作
植物原生質(zhì)體融合
開(kāi)啟電源,，關(guān)閉“輸出開(kāi)關(guān)”，將開(kāi)關(guān)搬向正弦輸出檔，此時(shí)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,，將正弦額度選擇在1—1.3MHz,，脈沖寬度為0.1ms或)10μs，脈沖幅度為150V,，脈沖頻率為1次/s,，并依次按下各標(biāo)定按鍵，zui后調(diào)整正弦電壓(即正弦幅度)旋扭,，使電壓表處于5-10V處,。 
    鹽酸多佐胺相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    122028-36-8    20mg
    阿那曲唑相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    120511-72-0    20mg
    氯吡格雷相關(guān)雜質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品    120202-71-3    20mg
    格列美脲相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品    119018-30-3     20mg
    格列美脲相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品    119018-29-0     20mg
 他唑巴坦酸相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    118175-11-4     20mg
    雷米普利相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品    108731-95-9     20mg
    利塞膦酸相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    105462-23-5    20mg
    奧芬那君相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品    10488-36-5     20mg
    奧昔布寧相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品    10399-13-0     20mg
轉(zhuǎn)化細(xì)胞