腫瘤細(xì)胞經(jīng)典四步法誘導(dǎo)iPSc肝分化 從生長狀態(tài)良好的iPSc中去除分化的細(xì)胞, 用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞, 接種至基質(zhì)膠包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿上, 用Duncan的四步法進(jìn)行肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將iPSc接種在基質(zhì)膠(matrigel)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上, 用經(jīng)典多能干細(xì)胞無滋養(yǎng)層培養(yǎng)基培養(yǎng),。細(xì)胞達(dá)70%匯合后, 先用4型膠原酶消化, 然后機械切割成小的細(xì)胞團(tuán)塊傳代。

1.2 誘導(dǎo)iPSc肝分化

1.2.1 經(jīng)典四步法誘導(dǎo)iPSc肝分化 從生長狀態(tài)良好的iPSc中去除分化的細(xì)胞, 用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞, 接種至基質(zhì)膠包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿上, 用 Duncan的四步法進(jìn)行肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,。*階段為內(nèi)胚層誘導(dǎo)階段, 分為a誘導(dǎo)和b誘導(dǎo), a誘導(dǎo)過程2d, 培養(yǎng)基為1640中添加2%B27,、100 ng/mLActivin A、10ng/mLBMP4(bone morphogenetic protein 4)和 20 ng/mL FGF2(fibroblast growth factor 2),。b誘導(dǎo)過程2 d, 培養(yǎng)基與a誘導(dǎo)所用相似, 不再添加BMP4和 FGF2,。第二階段為肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)階段, 共5 d, 培養(yǎng)基為1640中添加2%的B27、100 ng/mL Activin A,、 20 ng/mL BMP4和10 ng/mL FGF2,。第三階段為不成熟肝細(xì)胞誘導(dǎo)階段, 共5 d, 培養(yǎng)基為1640中添加2% B27和20 ng/mL HGF。第四階段為成熟肝細(xì)胞誘導(dǎo)階段, 培養(yǎng)基為商品化成熟肝細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen 公司 )加入 20 ng/mL的抑瘤素 M(oncostatin-M, OSM),。每階段分化后收獲細(xì)胞, 免疫熒光檢測蛋白質(zhì)水平, RT-PCR檢測mRNA水平,。

1.2.2 消化傳代破壞細(xì)胞連接 分別在第二階段和第三階段誘導(dǎo)結(jié)束, 胰蛋白酶消化破壞細(xì)胞連接。再次接種至基質(zhì)膠包被的細(xì)胞皿中, 分別進(jìn)行第三和第四階段誘導(dǎo),。階段誘導(dǎo)分化結(jié)束后收獲細(xì)胞, 免疫熒光檢測蛋白質(zhì)水平, RT-PCR檢測mRNA 水平, 比較經(jīng)典誘導(dǎo)成熟和消化傳代處理細(xì)胞間的差異,。

1.3 免疫熒光和RT-PCR檢驗分化指標(biāo)將未分化的iPSc接種至24孔板中免疫熒光檢測胚胎階段特異性抗原4(stage-specific embryonic antigen 4, SSEA4)和腫瘤識別抗原 -1-81(tumor recognition antigen-1-81, TRA-1-81)。免疫熒光檢測分化蛋白質(zhì)變化,。在分化過程中, 每一分化階段結(jié)束時收獲細(xì)胞, 一部分固定于玻片上, 進(jìn)行免疫熒光染色 (計數(shù)1×105 細(xì)胞, 使用cytospin離心機于1 500 r/min室溫離心4 min, 細(xì)胞貼附于玻片上, 行固定,、染色)。

在*階段和第二階段結(jié)束時, 分別檢測SOX17(sex determining region Y-box 17)和HNF4A的表達(dá), 通過 SOX17和HNF4A的陽性率鑒定本次分化的效果, 第二階段結(jié)束時兩者陽性率大于60%, AFP和ALB的表達(dá)為陰性, 進(jìn)行下階段誘導(dǎo)分化,。第三和第四階段分化結(jié)束時, 比較2種方法所得細(xì)胞AFP和ALB 陽性細(xì)胞百分率的差異,。RT-PCR檢驗分化過程中特異指標(biāo)mRNA變化。在每一階段完成時, 收獲細(xì)胞 提 取mRNA, 檢 測AFP(alpha-fetoprotein),、ALB,、 GATA結(jié)合蛋白6(GATA binding protein 6, GATA6)和 HNF4A變化情況, 以原代肝細(xì)胞為對照, 統(tǒng)計2種方法所得細(xì)胞mRNA水平的差異。

AFP引物-F: 5'-GCA GAG GAG ATG TGC TGG ATT G-3', AFP引物-R: 5'-CGT GGT CAG TTT GCA GCA TTC TG-3'; ALB 引物-F: 5'-GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG C-3', ALB引物-R: 5'-CAC GAC AGA GTA ATC AGG ATG CC-3'; GATA6引物-F: 5'-GCC ACT ACC TGT GCA ACG CCT-3', GATA6引物-R: 5'-CAA TCC AAG CCG CCG TGA TGA A-3'; HNF4A引物-F: 5'-GGT GTC CAT ACG CAT CCT TGA C-3', HNF4A引物-R: 5'- AGC CGC TTG ATC TTC CCT GGA T-3',。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計對于免疫熒光染色結(jié)果, 腫瘤細(xì)胞每分化組隨機計數(shù)3 個視野中陽性細(xì)胞所占比率, 用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示zui終結(jié)果, 用均值進(jìn)行卡方檢驗比較組間差異, P<0.05為存在顯著性差異,。對于RT-PCR結(jié)果, t檢驗比較組間差異, P<0.05為存在顯著性差異。
助壯素    Mepiquat chloride    高純,，99%    1克
豬膽酸鈉    Cholic aicd sodium Salt    CP,，98%    100克
珠光脂酸    Heptadecanoic acid    SP,，99.8%    25克
朱砂    Chinese red    CP    50毫升
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子    rhG-CSF    BR，98.5%    1克
重組人甲狀旁腺激素1-84    PTH1-84    BR,，98%    1克
重組人甲狀旁腺激素1-34    PTH1-34    BR,，95%    500毫克
重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑    rhIL-1ra    BR    500克
重組螞蟥素    Hirudin recombinant    BR，98%    100克
重碳酸鈉    Sodium hydrogen carboante    光譜級,，99.8%    100毫克
腫瘤細(xì)胞