貼壁細胞的傳代培養(yǎng)實驗操作方法

實驗原理

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,，已基本飽和，為使干細胞能繼續(xù)生長,，同時也將細胞數(shù)量擴大,，就必須進行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)是一種將細胞種保存下去的方法,，同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程,。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶,。

實驗材料

CO2培養(yǎng)箱,、倒置顯微鏡、超凈工作臺,、培養(yǎng)瓶,、試管、移液管,、巴斯德吸管,、廢液缸、75％秀精棉球,、酒精燈,、貼壁細胞株,、*培養(yǎng)基(RPMLI640或DMEM),、0.25％胰蛋白酶、PBS液,。

操作步驟

(1)傳代前準備

A.預熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的培養(yǎng)液,、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱,。

B.消毒：用75％酒精棉球擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

C.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間,，不僅便于操作而且可減少污染,。

D.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

E.超凈工作臺內(nèi)拆除已消毒空培養(yǎng)瓶的外包裝,。

F.取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液,，用酒精棉球擦拭好后放入超凈工作臺內(nèi)。

G.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出干細胞時要旋緊瓶蓋,，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,，再在顯微鏡下觀察細胞。

H.打開瓶口：將各瓶口一一打開,，同時要在酒精燈上燒口消毒,。

(2)胰蛋白酶消化

A.入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBs清洗(沖洗),，加入適量消化液(胰蛋白酶液),，注意消化液的量以蓋住細胞，*消化溫度是37℃,。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞,，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片,，表明此時細胞消化適度,。

C.終止消化：加入與消化液等體積的新鮮培養(yǎng)液。

(3)吹打分散細胞

A.打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液,。

B.吸細胞懸液人離心管：將細胞懸液吸人10 mL離心管中,。

C.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000r／min離心5 min,。

D.棄上清液,，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液,，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液,。

(4)分裝稀釋細胞

A.裝：將細胞懸液吸出分裝至2—3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋,。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量,，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,，傳代細胞的密度應該不低于5×105個／mL,。做好標記。

(5)繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋,，放人CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。傳代細胞2h后開始貼附在瓶壁上。

注意事項

A.嚴格的無菌操作,。

B.適度消化：消化的時間受消化液的種類,、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,，消化過程中應該注意培養(yǎng)干細胞形態(tài)的變化,，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散,，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化,。