貼壁細胞的傳代培養(yǎng)實驗操作方法

實驗原理

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,，已基本飽和,，為使干細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大,，就必須進行傳代(再培養(yǎng)),。傳代培養(yǎng)是一種將細胞種保存下去的方法，同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程,。懸浮型細胞直接分瓶就可以,，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

實驗材料

CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡,、超凈工作臺,、培養(yǎng)瓶、試管,、移液管,、巴斯德吸管、廢液缸,、75％秀精棉球,、酒精燈、貼壁細胞株,、*培養(yǎng)基(RPMLI640或DMEM),、0.25％胰蛋白酶、PBS液,。

操作步驟

(1)傳代前準備

A.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的培養(yǎng)液,、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

B.消毒：用75％酒精棉球擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手,。

C.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間,，不僅便于操作而且可減少污染。

D.點燃酒精燈：注意火焰不能太小,。

E.超凈工作臺內(nèi)拆除已消毒空培養(yǎng)瓶的外包裝,。

F.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,，用酒精棉球擦拭好后放入超凈工作臺內(nèi),。

G.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出干細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,，再在顯微鏡下觀察細胞,。

H.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒,。

(2)胰蛋白酶消化

A.入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液,，用PBs清洗(沖洗)，加入適量消化液(胰蛋白酶液),，注意消化液的量以蓋住細胞,，*消化溫度是37℃。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞,，若胞質(zhì)回縮,，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度,。

C.終止消化：加入與消化液等體積的新鮮培養(yǎng)液,。

(3)吹打分散細胞

A.打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。

B.吸細胞懸液人離心管：將細胞懸液吸人10 mL離心管中。

C.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中,，以1000r／min離心5 min,。

D.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液,，加入2mL培養(yǎng)液,，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

(4)分裝稀釋細胞

A.裝：將細胞懸液吸出分裝至2—3個培養(yǎng)瓶中,，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋,。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時計數(shù),。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于5×105個／mL。做好標(biāo)記,。

(5)繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,，適當(dāng)旋松瓶蓋，放人CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。傳代細胞2h后開始貼附在瓶壁上,。

注意事項

A.嚴格的無菌操作。

B.適度消化：消化的時間受消化液的種類,、配制時間,、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)干細胞形態(tài)的變化,，一旦胞質(zhì)回縮,，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化,。