檢測干細胞四唑鹽比色法試驗原理
此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物，并沉積在細胞中,，而干細胞無此功能,。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的藍紫色結(jié)晶物,，用酶聯(lián)免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值,，可間接反應活細胞數(shù)量,。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比,。
●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞,，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基配成1x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,，每孔100ul,。
●將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱中，在37℃,、5%CO2條件下,，培養(yǎng)3-5天。
●培養(yǎng)3-5天后,，每孔加入MTT溶液10ul,，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3-6h，終止培養(yǎng),，加10%SDS-HCl 100ul/孔,，37℃培養(yǎng)數(shù)小時,，將細胞內(nèi)與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔吸光度（OD）,，選波長490nm,。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線,。
用此法測干細胞活力,，為保證結(jié)果的準確性，在試驗前測定每種細胞的貼比率,、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線,，再確定每孔細胞接種數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止時不會過滿,。另外，實驗時設空白對照,，比色時,，以空白孔調(diào)零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析,。
● 制備細胞懸液：細胞計數(shù)
● 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100ul細胞懸液,，同樣的樣本可做3個重復,。
● 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁,，這步可以省去,。
●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,。或者直接配置含10%CCK8的培養(yǎng)基,，以換液的形式加入,。
●培養(yǎng)1-4小時:干細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣,。如果顯色不夠的話,，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認*條件,。特別是血液細胞形成的Formazan很少,，需要較長的顯色時間（5-6小時）,。
●測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,。