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液相色譜法與液相色譜儀
閱讀：2464 發(fā)布時間：2017-2-15液相色譜法是20世紀60年代末在經(jīng)典液相色譜的基礎上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代色譜分析方法,，歷*曾出現(xiàn)過不同的叫法,，如,，高壓液相色譜（HPLC）,、高速液相色譜（HSLC）和高分辨液相色譜（HRLC）。就分離原理而言,，HPLC與經(jīng)典柱層析（色譜）沒有本質的區(qū)別,，但由于采用了高壓輸液泵、微粒固定相和高靈敏度檢測器,，HPLC在分析速度,、分離效率、檢測靈敏度和操作自動化方面,，都達到了可與GC相比的程度,，并保持了樣品適用范圍廣、流動相種類多和便于制備的柱層析優(yōu)點,，在生物工程,、制藥工業(yè)、食品工業(yè),、環(huán)境監(jiān)測和石油化工等領域獲得了廣泛的應用,！
HPLC的特點：
①樣品適用范圍廣；
②分離效率高,；
③檢測靈敏度高,；
④分析速度快；
⑤樣品回收方便,；
液相色譜法的分類：
HPLC的分類方法有多種,，比較常見的有三種：
（1）按照分離機理分類：
①吸附色譜
②分配色譜
③離子交換色譜（IEC）
④體積排阻色譜（SEC）
⑤親和色譜（AC）
（2）按照色譜柱洗脫動力學分類:
①洗脫法
②前沿法
③置換法
（3） 按照分離目的分類：
①分析液相色譜
②制備液相色譜
HPLC分析常用的樣品處理技術:
粉碎、冷凍干燥,、氣體萃?。斂辗治龊痛祾?捕集）、溶劑萃?。ɑ亓骰蛩魇陷腿?，加壓溶劑萃取）,、固相萃取,、固相微萃取、超臨界流體萃取,、微波萃取,、超聲波萃取,、微透析、衍生化,、膜分離,、蒸餾、吸附,、離心,、過濾、濃縮和溶解等,。
色譜定性分析方法
標準物質對照定性,；
利用文獻數(shù)據(jù)定性；
利用選擇性檢測器定性,；
在線聯(lián)用儀器定性,；
其它定性方法；
液相色譜儀使用及維護方法
液相色譜儀使用時要非常注意,！
使用卡套柱時,，兩端的卡套應時刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗,，任何時候都不能將卡套取下來,，否則會造成填料的流失。
液相色譜柱使用注意：
卡套柱的安裝（加預柱）：
將卡套架套入柱芯
將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽,，使夾套高于柱芯
將已套到柱芯上的卡套架向上推,，直至高過夾套片
將“子彈頭”預柱放入卡套片內
將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手擰緊
然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
平衡色譜柱
反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的,。請一定確保您所使用的流動相和乙腈/水互溶,。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前,，應使用10～20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱,；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水“過渡”,。
硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的,。如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請在使用流動相之前用乙醇或異丙醇平衡
如何平衡色譜柱,？
平衡過程中,，將流速緩慢地提高用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時間來平衡）
色譜柱的再生
進行色譜柱再生時,，應使用一個廉價的泵,，我們建議不使用您的液相色譜儀上的泵。
注意：
在對NH2改性的色譜柱進行再生時,，由于NH2可能成銨根離子的形式存在,，因此,，應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出,。如果簡單的有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質,，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
液相色譜的常用術語
1.色譜曲線（chromatogram）：
在色譜法中,，當樣品加入后,，樣品中各組分隨著流動相的不斷向前移動而在兩相間反復進行溶解、揮發(fā),，或吸附,、解吸的過程,。如果各組分在固定相中的分配系數(shù)（表示溶解或吸附的能力）不同,，就有可能達到分離。
分配系數(shù)小的組分滯留在固定相中的時間短,，在柱內移動的速度快,，先流出柱子；分配系數(shù)大的組分滯留在固定相中的時間長,，在柱內移動的速度慢,，后流出柱子；分離后的各組分經(jīng)檢測器轉換成電信號而記錄下來,，得到一條信號隨時間變化的曲線,，稱為色譜流出曲線或 “色譜峰”，理想的色譜流出曲線應該是正態(tài)分布曲線,。
2.（色譜）峰（chromatographic peak）：
色譜柱流出組分通過檢測器系統(tǒng)時所產生的響應信號的微分曲線,。
3.峰底（peak base）：
峰的起點與終點之間的連接的直線。
4.峰高（h,，peak height）：
色譜峰zui大值點到峰底的距離,。
5.峰寬（W ，peak width）：
在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點的距離,。
6.半高峰寬（Wh/2 ,，peak with d at half height）：
通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側相交兩點之間的距離（圖1 中的HJ）,。
7.峰面積（A ,，peak area）：
峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）。
8.拖尾峰（tailing peak）：
后沿較前沿平緩的不對稱的峰,。
9.前伸峰（leading peak）：
前沿較后沿平緩的不對稱的峰,。（又叫伸舌峰、前延峰）
10.假峰（ghost peak）：
除組分正常產生的色譜峰外,，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰,，即并非由試樣所產生的峰,。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性,、定量帶來誤差,。（又叫鬼峰）
11.畸峰（distrorted peak）：
形狀不對稱的色譜峰，前伸峰,、拖尾峰都屬于這類,。
12.反峰（negative peak）：
也稱倒峰、負峰,，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰,。