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細(xì)胞養(yǎng)不好，注意這些細(xì)節(jié)

養(yǎng)細(xì)胞是一件戳心戳肺的事情,，你要像照顧小孩一樣仔細(xì)對(duì)待,，愛(ài)護(hù)她，呵護(hù)她,。如果你照顧的時(shí)候能注意這些問(wèn)題,，會(huì)讓你的細(xì)胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細(xì)胞的注意事項(xiàng)跟大家交流一下,。

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細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

在您帶上手套開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后再次出入操作臺(tái)，這樣可以降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn),。

細(xì)胞培養(yǎng)基也應(yīng)先預(yù)熱,選擇只預(yù)熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間,而且可以避免因反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質(zhì)降解,。

結(jié)束操作后,別忘了培養(yǎng)基對(duì)光敏感,應(yīng)盡可能避光保存。

細(xì)胞培養(yǎng)的定期檢查

定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài),，即形狀和外觀,，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取得成功至關(guān)重要。

除確認(rèn)細(xì)胞的健康狀態(tài)外,，每次操作細(xì)胞時(shí)通過(guò)肉眼和顯微鏡檢查細(xì)胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象,，避免污染擴(kuò)散至實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。

細(xì)胞變質(zhì)的征象

細(xì)胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒,、細(xì)胞與基質(zhì)解離以及細(xì)胞質(zhì)空泡形成,。

這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：

培養(yǎng)物污染,、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì),，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

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變質(zhì)嚴(yán)重時(shí)將會(huì)成為不可逆的變化,。

細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥的消毒及布局

保持細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)的整潔有序,，將所有物品置于直視范圍內(nèi)。

向放入通風(fēng)櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇,，擦拭清潔進(jìn)行消毒,。

在通風(fēng)櫥中部開(kāi)闊處放置細(xì)胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用,；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸?。辉嚬芗苤糜谥泻蟛?；小型容器置于左后部用于盛放廢液,。

培養(yǎng)瓶/皿等物品的無(wú)菌操作

無(wú)菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶,、培養(yǎng)皿等物品使用時(shí)方可揭開(kāi)蓋子,，不得將其開(kāi)放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子,，取下蓋子時(shí)應(yīng)將蓋子開(kāi)口朝下放在工作臺(tái)面上,。

進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)不要說(shuō)話、唱歌或吹口哨,。盡快完成實(shí)驗(yàn),，以盡量避免污染。

細(xì)胞培養(yǎng)中可能的污染物

細(xì)胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：

化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基,、血清和水中的雜質(zhì),、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑,。

生物污染物,，如細(xì)菌、霉菌,、酵母,、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染,。

可通過(guò)充分了解污染源以及采用良好的無(wú)菌技術(shù),，降低污染發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度。

交叉污染的確認(rèn)

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細(xì)胞及其他生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是個(gè)明確的問(wèn)題,，會(huì)造成嚴(yán)重后果,。

從聲譽(yù)好的細(xì)胞庫(kù)獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系性質(zhì)及采用良好的無(wú)菌技術(shù)有助于避免交叉污染,。

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通過(guò)DNA指紋圖譜,、核型分析和同位素分析可確認(rèn)有無(wú)交叉污染。

細(xì)胞換液注意事項(xiàng)

為細(xì)胞換液時(shí),，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入,，而不是直接加到細(xì)胞中，以免損傷細(xì)胞,，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞株較為脆弱時(shí)尤其需要注意,。

使用無(wú)菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時(shí),，每支吸管只能使用一次,，以免交叉污染。

細(xì)胞傳代的時(shí)間把握

當(dāng)細(xì)胞呈指數(shù)增殖,，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞已占據(jù)所有可用基質(zhì),、沒(méi)有擴(kuò)增空間，或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞已超過(guò)培養(yǎng)基質(zhì)所支撐的能力,，無(wú)法進(jìn)一步生長(zhǎng)時(shí),，細(xì)胞增殖速度將大大降低甚至*停止。

為了將細(xì)胞密度維持在zui佳水平,，以便細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng),，并且刺激進(jìn)一步增殖，必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代,。

細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)長(zhǎng)期使用抗生素,，因?yàn)檫B續(xù)使用抗生素會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在,。

抗生素只能作為對(duì)付污染的zui后手段短期使用,，并盡快撤除。

如果長(zhǎng)期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無(wú)抗生素培養(yǎng),，以便作為鑒別隱性感染的對(duì)照,。

細(xì)胞凍存的必要性

連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細(xì)胞系zui終會(huì)發(fā)生衰老,，所有培養(yǎng)的細(xì)胞都易受到微生物污染,，即使運(yùn)轉(zhuǎn)情況zui好的實(shí)驗(yàn)室也會(huì)遇到設(shè)備故障的問(wèn)題。

由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴資源,，更換細(xì)胞系成本高昂,，而且耗費(fèi)時(shí)間，因此,，必須將其冷凍起來(lái),，長(zhǎng)期保存。

細(xì)胞凍存的事項(xiàng)

應(yīng)在細(xì)胞濃度高的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)凍存,，并且細(xì)胞傳代的次數(shù)盡可能少,。

在凍存前確保活細(xì)胞的百分比至少為90%,。

請(qǐng)注意,，zui佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。

凍存和復(fù)蘇過(guò)程對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)造成不利影響,，因此不要通過(guò)渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細(xì)胞脫落（培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)除外）,，也不要高速離心細(xì)胞。

凍存培養(yǎng)基的選擇

凍存細(xì)胞時(shí)必須選擇凍存培養(yǎng)基,，凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有DMSO或者甘油等冷凍保護(hù)劑,。

還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基，例如HyClone,、HAKATA的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基,。

細(xì)胞培養(yǎng)溫度的設(shè)定

細(xì)胞培養(yǎng)的zui佳溫度主要取決于細(xì)胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響,，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度,。

與溫度過(guò)低相比，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)溫度過(guò)高時(shí)更為嚴(yán)重的問(wèn)題：因此,，往往將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為略低于zui佳溫度,。

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各類細(xì)胞培養(yǎng)的zui佳溫度

大多數(shù)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在36℃~37℃下具有zui佳生長(zhǎng)狀態(tài),。

昆蟲(chóng)細(xì)胞在27℃具有zui佳生長(zhǎng)狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內(nèi),，細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,。

溫度超過(guò)30℃時(shí)，昆蟲(chóng)細(xì)胞活力降低,，即使溫度降至27℃,，細(xì)胞活力也無(wú)法恢復(fù)。

禽類細(xì)胞系在38.5℃時(shí)具有zui佳生長(zhǎng)狀態(tài),。雖然此類細(xì)胞也可在37℃下培養(yǎng),，但其生長(zhǎng)速度會(huì)變慢。

來(lái)源于冷血?jiǎng)游铮ɡ纾簝蓷珓?dòng)物,、冷水魚(yú)）的細(xì)胞系可耐受很寬的溫度范圍,，為15-26℃。

請(qǐng)注意每種細(xì)胞的培養(yǎng)條件均有所不同,，偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表型異常,，甚至培養(yǎng)*失敗。

因此,，我們建議您應(yīng)熟悉自己使用的細(xì)胞系,，實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說(shuō)明。

細(xì)胞培養(yǎng)的zui適pH

大多數(shù)正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長(zhǎng)良好,，而且不同細(xì)胞株間差異極小,。

但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時(shí)生長(zhǎng)較好,，而有些正常的成纖維細(xì)胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7,。

Sf9和Sf21等昆蟲(chóng)細(xì)胞系zui適合在pH值為6.2的環(huán)境中生長(zhǎng),。

細(xì)胞培養(yǎng)基zui適pH的控制

細(xì)胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值,，為培養(yǎng)的細(xì)胞緩沖pH值的變化。

這種緩沖作用通常是通過(guò)添加有機(jī)緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實(shí)現(xiàn),。

由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡,，因此空氣中二氧化碳含量的變化會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值。

為此,，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時(shí)必須使用外源性二氧化碳,，特別是使用開(kāi)放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞或者進(jìn)行高濃度的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)。

細(xì)胞培養(yǎng)中血清的保存

細(xì)胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同,，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細(xì)胞種類和培養(yǎng)要求來(lái)挑選出zui適合的血清,。

我們建議將血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月,。

若您無(wú)法一次用完一瓶,，建議您將血清無(wú)菌分裝至合適體積的滅菌容器內(nèi)，再放回冷凍箱保存,。

解凍血清時(shí),，建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過(guò)夜融解,，然后在室溫下使之全融,。需要注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻,。

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如何在細(xì)胞鋪板時(shí)避免“邊緣效應(yīng)”

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鋪板時(shí),，為避免“邊緣效應(yīng)”,，以應(yīng)用96孔板的中間60孔為zui佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細(xì)胞,，只做空白或陰性對(duì)照,。

鋪板時(shí)，細(xì)胞懸液一定要混勻,，以避免細(xì)胞沉淀下來(lái)而導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等,，可以每接幾個(gè)就再混勻一下。

加樣器操作要熟練,，盡量避免人為誤差,。此外，吹散次數(shù)過(guò)多也會(huì)影響細(xì)胞活力,。所以要熟練操作,，盡快上板。

何時(shí)選擇使用熱滅活血清

加熱血清可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng),。

啟動(dòng)的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件,，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺,，啟動(dòng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化,。

在免疫學(xué)研究,、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),，推薦使用熱滅活血清,。

熱滅活血清可能出現(xiàn)的現(xiàn)象

在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞,、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),，推薦使用熱滅活血清。

而對(duì)于其他大多數(shù)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)是不需要熱滅活血清的,。

熱滅活血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),，或*沒(méi)有任何作用，甚至可能因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量,，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低,；經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物會(huì)顯著地增多,，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染,，而把血清放在37度環(huán)境中,，又會(huì)使此沉淀物增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增,。

您可以根據(jù)您的研究需要選擇是否需要熱滅活血清,。

如此一來(lái)，不但能確保血清的質(zhì)量,，而且能夠節(jié)省您寶貴的時(shí)間,。

如何正確熱滅活血清

熱滅活時(shí)請(qǐng)將血清置于56℃水浴30分鐘。

為盡量減少熱滅活對(duì)血清品質(zhì)的影響,，一次滅活的血清體積不宜過(guò)大,。

zui好準(zhǔn)備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時(shí)將裝有血清和水的容器同時(shí)放入56℃水浴,，在裝水的容器中放置溫度計(jì),，加熱過(guò)程中不時(shí)地輕輕旋轉(zhuǎn)混勻血清，當(dāng)溫度計(jì)顯示達(dá)到56℃左右,，開(kāi)始計(jì)時(shí),。

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