A549細(xì)胞 A549細(xì)胞株的凍存與復(fù)蘇

產(chǎn)品名稱：A549細(xì)胞

中文名稱：非小細(xì)胞癌細(xì)胞

規(guī)       格:1~3*106細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異,，有時(shí)因寄贈(zèng),、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,，*的策略是進(jìn)行低溫保存,。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn),。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí),，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),，故可以長期保存,。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程,。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀,，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷,。
一、細(xì)胞的凍存：為避免污染造成的損失,，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化,，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前,，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染,。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下：
包含10％甘油的*培養(yǎng)基,，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基,，
50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基,。
對(duì)于無血清培養(yǎng)基,，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基,。
1,、懸浮細(xì)胞
計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長期,。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞,。
以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度,，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×1027在無血清培養(yǎng)基中,，再次懸浮細(xì)胞,。
分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。
細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。
2、貼壁細(xì)胞
使用分離試劑從基層分離細(xì)胞,，分離時(shí)盡可能溫和,，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小。
在*生長培養(yǎng)基中,，再次懸浮分離細(xì)胞,，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,。使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細(xì)胞。
以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度,，在凍存液中懸浮細(xì)胞,。
分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。
細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。
二,、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作,。凍存細(xì)胞要快速融化,，并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑（DMSO或甘油）敏感,，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長培養(yǎng)基中。
1,、直接鋪板方法
取出貯存細(xì)胞,，37℃水浴中快速融化。
直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞,。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基,。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml,。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí),，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑,。
2,、離心方法
取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化,。
把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基,，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘,。
棄去上清,。
在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),。
細(xì)胞鋪板,，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml