A4/Fuk細胞 A4/Fuk細胞株的凍存與復蘇

產(chǎn)品名稱：A-375細胞

中文名稱：彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

規(guī)       格:1~3*106細胞/25cm2培養(yǎng)瓶

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異,，有時因寄贈,、交換和購買,，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室,，*的策略是進行低溫保存,。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點,。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時,，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態(tài),，故可以長期保存,。細胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程,。在此溫度范圍內(nèi),，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷,。
一,、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細胞,。凍存細胞前,，細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞,。對于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下：
包含10％甘油的*培養(yǎng)基，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基,，
50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基,，或
50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基,，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
50％ 細胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
1,、懸浮細胞
計數(shù)將要凍存的活細胞,。細胞應該處于對數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞,，使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度,，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞,，或者以0.5×107到1×1027在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細胞,。
分裝進凍存管,，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。
2,、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和,，使對細胞的損傷減少到zui小,。
在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞,，確定有活力細胞數(shù),。
以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細胞,。
以5×106到1×106細胞/ml密度,，在凍存液中懸浮細胞。
分裝進凍存管,，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
二,、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱,，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,，并直接加入*生長培養(yǎng)基中,。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長培養(yǎng)基中,。
1、直接鋪板方法
取出貯存細胞,，37℃水浴中快速融化,。
直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基,。進行活細胞計數(shù),，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養(yǎng)細胞12到24小時,，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基,，去除凍存劑。
2,、離心方法
取出貯存細胞,，37℃水浴中快速融化,。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基,，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘,。
棄去上清,。
在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數(shù),。
細胞鋪板,，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。