細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

 1 懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用歷史和現(xiàn)狀

1962年，Capstick等對(duì)BHK21細(xì)胞馴化實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng),，并用于獸用疫苗生產(chǎn),。1967年,，Van Wezel又開發(fā)了微載體并實(shí)現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,。到20世紀(jì)80年代,，CHO細(xì)胞實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng),，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)著生物反應(yīng)器在生物制藥行業(yè)中的應(yīng)用,，到20世紀(jì)末已進(jìn)入萬升級(jí)規(guī)模,。

2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng),、個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基等技術(shù)的發(fā)展,，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設(shè)備的生物反應(yīng)器規(guī)模也趨向大型化和簡(jiǎn)單化。現(xiàn)在,，10000L及以上體積的反應(yīng)器達(dá)一百多臺(tái),，zui大已達(dá)25000L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C(jī)械攪拌式反應(yīng)器,，主要為Genetech,、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有,。2007年銷售額zui高的6大類生物技術(shù)藥物中,，有5類是經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的?？v觀國(guó)內(nèi),，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過110家，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的僅4家,。一般獸用疫苗企業(yè)采用國(guó)內(nèi)自主開發(fā)的650 L和1200 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗,。

2懸浮培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)

懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要包括高表達(dá)細(xì)胞株的獲得,、個(gè)性化培養(yǎng)基的研發(fā),、動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器及配套設(shè)施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個(gè)方面。

2.1 細(xì)胞與毒株的馴化

為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性,，在生物反應(yīng)器中繁殖的病毒與細(xì)胞需要進(jìn)行相互適應(yīng)選擇,，針對(duì)不同的毒株及其表達(dá)量篩選適合的宿主細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

為實(shí)現(xiàn)馴化的穩(wěn)定,，通常由高密度細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向低密度細(xì)胞培養(yǎng),，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞馴化時(shí)應(yīng)該注意保持細(xì)胞活力應(yīng)90%以上,，測(cè)定細(xì)胞增殖能力的和表達(dá)分泌能力進(jìn)行,，避免馴化后的細(xì)胞表達(dá)特性發(fā)生變化。馴化后細(xì)胞的增殖能力,、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要,。由于特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求不同，實(shí)現(xiàn)其馴化的難易程度也不同,，在馴化時(shí)需要選用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基,，有針對(duì)性地補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞的特定需求，使馴化好的細(xì)胞可以保持其懸浮或是無血清生長(zhǎng)的特性,。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)基的個(gè)性化

在大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)中,，維持細(xì)胞高密度甚至無血清生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量對(duì)細(xì)胞的增殖、維持至關(guān)重要,。在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中,，不同細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝的特異性不同，細(xì)胞和病毒培養(yǎng)工藝不同,，需要抗剪切力,、滿足放大功能，還需要提高目標(biāo)生物制品的穩(wěn)定性,、表達(dá)量,，這些均需要個(gè)性化培養(yǎng)基的支持。我國(guó)銷售的細(xì)胞培養(yǎng)基卻多為20世紀(jì)50年代發(fā)明的MEM,、DMEM,、199、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基等,，這些目錄產(chǎn)品難以滿足生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)要求,，直接影響了生物制藥行業(yè)技術(shù)升級(jí)。從對(duì)人類和動(dòng)物安全性的長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮,，生物制品生產(chǎn)越來越傾向采用無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基,，因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對(duì)細(xì)胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化,、回收率高,，上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基,。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)工藝的研發(fā)

懸浮培養(yǎng)過程技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用主要是生產(chǎn)工藝的開發(fā)和工藝過程優(yōu)化,，維持細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖的*化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中的作用同樣至關(guān)重要,。

2.3.1懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)技術(shù)按細(xì)胞貼壁性分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng),。懸浮細(xì)胞可以在反應(yīng)器中直接生產(chǎn)增殖，細(xì)胞自由生長(zhǎng),、培養(yǎng)環(huán)境均一,、取樣簡(jiǎn)單、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單可控,、放大方便,、污染率和成本低;而貼壁細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細(xì)胞和球體接觸部位營(yíng)養(yǎng)環(huán)境較差,，培養(yǎng),、取樣觀察及放大工藝復(fù)雜，成本高,。

雖然相對(duì)于懸浮培養(yǎng),，微載體培養(yǎng)復(fù)雜，但與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢(shì)，能提高生產(chǎn)規(guī)模,、產(chǎn)品質(zhì)量和勞動(dòng)效率,，因此是貼壁細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。常見的微載體有實(shí)體的Cytodex微載體,、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體,。使用DISK或Cytopore時(shí)細(xì)胞貼附于載體內(nèi)部生長(zhǎng)，表面細(xì)胞較少,，難以使用細(xì)胞消化等方法將載體和細(xì)胞進(jìn)行分離,，且反應(yīng)器放大工藝?yán)щy，不適合非釋放病毒的培養(yǎng),。而Cytodex比較適應(yīng)罐倒罐的反應(yīng)器放大工藝,，目前報(bào)道的貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝的*形式是機(jī)械攪拌式反應(yīng)器實(shí)體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)zui有效的優(yōu)化工藝和zui適宜的工藝設(shè)計(jì),，其*工藝設(shè)計(jì)體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng),。

2.3.2懸浮培養(yǎng)方式

選擇反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)方式需要考慮細(xì)胞和病毒的關(guān)系、產(chǎn)物穩(wěn)定性,、細(xì)胞培養(yǎng)基或添加物的選擇,、細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個(gè)因素。按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng),、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng),。

批培養(yǎng)能直觀反映細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)、代謝變化,，操作簡(jiǎn)單,，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細(xì)胞生長(zhǎng),，細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高;流加培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高,、容易放大,，應(yīng)用廣泛，但需要進(jìn)行流加培養(yǎng)基的設(shè)計(jì);灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小,，回收體積大,，產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存,，利于保持產(chǎn)品的活性,，但操作比較繁雜、細(xì)胞培養(yǎng)基利用效率低,、旋轉(zhuǎn)過濾器容易堵塞等,。不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對(duì)于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng),，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng),。

同一生物制品由于其營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化,，如BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒,，低血清培養(yǎng)時(shí)采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無血清的維持液;而無血清培養(yǎng)過程中無需換液,，配合流加培養(yǎng)可能效果更好,。

3 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在畜禽疫苗中的應(yīng)用

目前疫苗免疫是控制動(dòng)物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質(zhì)量,，降低疫苗成本已成為各大動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn),。工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗是提高疫苗質(zhì)量，降低成本的有效手段,。

3. 1 豬病毒病疫苗

狂犬病毒在2 L的生物反應(yīng)器繁殖,，病毒zui大滴度能夠達(dá)到1.38×108pfu/ mL，且生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量達(dá)到WHO要求,。無血清微載體細(xì)胞培養(yǎng)有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產(chǎn),。同樣有不少關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)豬偽狂犬、豬藍(lán)耳病,、豬口蹄疫,、豬瘟、豬細(xì)小病毒病等疾病疫苗的報(bào)道,。

3. 2 禽病毒病疫苗

禽類疫苗主要通過SPF雞胚生產(chǎn),，但雞胚生產(chǎn)疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產(chǎn)周期長(zhǎng),，易污染,，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個(gè)病毒毒株。因此,，SPF雞胚生產(chǎn)疫苗的效率很低,。我國(guó)已經(jīng)能夠通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)出符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的雞傳支H120細(xì)胞弱毒苗。楊濤等也報(bào)道了禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中大規(guī)模增殖規(guī)律,。國(guó)外有不少關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽馬立克病毒,、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎,、產(chǎn)蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報(bào)道,。

4 展望

應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用只是搭建了一個(gè)升級(jí)工藝的平臺(tái),，而不是zui終目的,，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動(dòng)力是新獸藥,、新疫苗、新工藝以及配套技術(shù)的創(chuàng)新,。

例如無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和無血清培養(yǎng)病毒生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染或馴化技術(shù)實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)構(gòu)建;新宿主細(xì)胞表達(dá)品種開發(fā),，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細(xì)胞表達(dá)或是開發(fā)一種表達(dá)的宿主細(xì)胞適應(yīng)幾種產(chǎn)品的表達(dá)等?？偠灾?，整合行業(yè)li量，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的升級(jí)換代是未來幾年我國(guó)生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn),。這個(gè)過程應(yīng)重視成熟技術(shù),、成功率，減少和避免時(shí)間,、資金,、人力等資源的浪費(fèi)，減少機(jī)會(huì)成本,，搶占市場(chǎng)先機(jī),。

懸浮培養(yǎng)技術(shù)的升級(jí)將導(dǎo)致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢(shì),，有實(shí)力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥,、新技術(shù)研發(fā)為基礎(chǔ)和核心競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)借助資金實(shí)力整合制造和營(yíng)銷體系,，成為真正意義上的,。