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牛血清白蛋白(BSA)的應(yīng)用

時間:2023-8-29閱讀:798

牛血清白蛋白(BSA)是牛血清中的一種球蛋白,,包含607個氨基酸殘基,,分子量為66.446KDa,,等電點為4.7,。

應(yīng)用:
牛血清白蛋白(BSA)在生化實驗中有廣泛的應(yīng)用,,例如在WB實驗中加入BSA,,通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度,,對酶起保護(hù)作用。
防止酶的分解和非特異性吸附,,能減輕有些酶的變性減輕不利環(huán)境因素,,如加熱、表面張力及化學(xué)因素引起的變性,。

測定蛋白濃度
按50:1配置BCA工作液,。
10ulC液(蛋白標(biāo)準(zhǔn))+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。
再分別以0,、1,、2、4,、8,、12、16,、20ul將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加入96孔板的第1~8標(biāo)準(zhǔn)孔中,,在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。
分別加PBS定容至20ul,。
各孔中加入200ulBCA工作液,,室溫放置2小時。
用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度:測定A562,,依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度,。

SDS-PAGE電泳
1、制膠:按比例配制分離膠,,緩緩地?fù)u動溶液,,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,,再在液面上小心注入一層水,,以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中,靜置40min,。
同前按比例配制濃縮膠,,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。
吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,,連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液,,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制60min以上以保證聚合,。
2,、預(yù)電泳:將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預(yù)電泳20-30min,。
(目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),, 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通)。
3,、樣品準(zhǔn)備:首先計算上樣體積,,然后按樣品上樣buffer=4:1的比例加入上樣bufer混勻,沸水10分鐘,,冰上5分鐘,。
4、加樣:預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品(Marker)和待分析樣品,。
(加樣時間要盡量短,,以免樣品擴散,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng),。每個泳道加5ul 。)
5,、電泳:加樣完畢,,選擇80V恒壓進(jìn)行電泳,電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)兩膠交界處(一般約20分鐘),,更換至100V恒壓電泳,,電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳(一般約為1小時20分鐘),。

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