細胞培養(yǎng)的基本原理：細胞傳代（生存空間和營養(yǎng)不足,，長得太密,，代謝廢物太多,，要洗洗,，同時也要分離出一部分細胞,，要加入新的培養(yǎng)液），換液（生存空間和營養(yǎng)剩余,，但是代謝廢物太多,，要洗洗，要吃飯,，才能長好,，所以要洗和加入新鮮培養(yǎng)基），凍存（太多了,，先存起來,，液氮里面里就是低溫，保存能量,，活得久）,，復蘇（解凍,，恢復吃飯的能力，恢復生長,。）這四步,。

細胞培養(yǎng)的基本步驟（一定要明白每個步驟的意義和目的）：

01細胞傳代（貼壁細胞）：

試劑：PBS,胰酶，含血清的培養(yǎng)基,；

流程：顯微鏡下看一看培養(yǎng)皿里的細胞多不多,，太多（80%~90%）會導致代謝廢物很多，先吸掉廢液,，再用PBS洗一洗,，同時太多會導致細胞黏在一起，這時候就需要加點胰酶消除它們之間的粘性,，是否消除完,，在顯微鏡下看一看，看完加入適宜的含血清的培養(yǎng)基,，中和一下胰酶,，這叫吹打，除此之外,，細胞太多了,，把一部分細胞移出來，加入適量的培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng),，這叫傳代,。

02細胞換液：

試劑：PBS，含血清的培養(yǎng)基,；

流程：先吸掉代謝廢物（即細胞瓶中的培養(yǎng)液）,，再用PBS洗一洗，由于細胞長得不是很多,，細胞之間沒有黏在一起,，因此不需要加入胰酶來消除它們之間的粘性。由于細胞要吃飯,，加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基,，最后放到孵箱里面進行培養(yǎng)。

03細胞凍存：

試劑：凍存液,，PBS,，胰酶，含血清的培養(yǎng)基,；

流程：要凍存,，先配置凍存液，凍存液包含了：DMSO：防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細胞時,，細胞內(nèi)液會形成冰晶,，滲透壓會發(fā)生改變,，細胞結構會出現(xiàn)紊亂，會導致細胞出現(xiàn)損傷,。凍存液制備時,，一般需與血清一起配置：因為兩者互融時，會散發(fā)熱量,，所以凍存液需提前制備,。

因為細胞太多了，需要凍存,，所以要先看一看,，吸一吸，洗一洗,，分一分,，中和一下，吹打制成細胞懸液,，離心,，吸掉上清液，加入凍存液,，輕輕吹吸均勻,，每管等量1ml裝入凍存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃過夜,，最后放入液氮罐,。

04細胞復蘇：

試劑：含血清的培養(yǎng)基；

流程：從液氮中取出凍存管,，迅速（小于3min）置于37℃水浴鍋中,，解凍時，邊晃動邊觀察,，當看到只有一小塊冰存在時，即可從水浴鍋中取出,，打開凍存管,，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻,，1000r/min,離心五分鐘,，吸掉上清液，沉淀中加入適量培養(yǎng)液,，放入孵箱中,，培養(yǎng)。還有就是：復蘇的細胞,，需要在24小時后,，換一次培養(yǎng)液,。