細(xì)胞培養(yǎng)的路上,，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中,，細(xì)胞點(diǎn)點(diǎn),，引無(wú)數(shù)英雄競(jìng)掛東南枝。
正所謂“萬(wàn)事開(kāi)頭難",，即便是細(xì)胞復(fù)蘇與保存這兩件看似簡(jiǎn)單的事情,，也能造成實(shí)驗(yàn)汪內(nèi)心無(wú)比巨大的陰影面積。
其實(shí),，剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞就像是剛剛出生的baby，非常脆弱,，需要各位小伙伴的細(xì)心呵護(hù),，不然，細(xì)胞就會(huì)被我們花樣養(yǎng)死,。為了避免細(xì)胞不明不白的掛掉,，我們就要對(duì)細(xì)胞的各種習(xí)性了如指掌。1. 俗語(yǔ)道,，到什么山上唱什么歌,，不同細(xì)胞用不同的培養(yǎng)液。此時(shí),，就不得不提起培養(yǎng)基里的“四大金剛"—MEM,、DMEM、1640,、F-12,，它們基本參與了90%以上種類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。MEM作為帶頭大哥,，能力非常全面,，號(hào)稱(chēng)是應(yīng)用廣泛的細(xì)胞培養(yǎng)液。DMEM作為隨時(shí)緊跟老大MEM的二弟,，青出于藍(lán)而勝于藍(lán),，濃度要高出2~4倍，可分為高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）,。老三1640中規(guī)中矩,，營(yíng)養(yǎng)成分比較簡(jiǎn)單,，比DMEM少一點(diǎn)糖和谷光甘肽，常用于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng),。小兄弟F12常用來(lái)支持CHO,、Hela和L－細(xì)胞生長(zhǎng)以及原代大鼠肝細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。MEM和F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2,，即可形成神經(jīng)生物學(xué)通用的培養(yǎng)基,。
2. 細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。具體養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)該摸索細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度,，即不能讓細(xì)胞瓶里的細(xì)胞因擁擠不堪而萎靡不振,；也不能讓細(xì)胞濃度低于1~5×105個(gè)/mL而導(dǎo)致“孤獨(dú)死"（因?yàn)榧?xì)胞的健康生長(zhǎng)需要細(xì)胞間的連接）。因而細(xì)胞接種前,，要先通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整細(xì)胞濃度,。3. 當(dāng)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞形態(tài)不好時(shí)，可在傳代時(shí),，先倒掉舊的培養(yǎng)基,，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無(wú)血清都可以）洗滌一次，用滴管吸走,，再加入3ml培養(yǎng)基,，沿著瓶底輕輕吹打一遍，然后吸走,。這時(shí)在正式進(jìn)行消化,、吹打。其次,，把吹打下的細(xì)胞懸液加入到含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況（10min,20min,30min）,。而后迅速倒出其中的培養(yǎng)基,，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次，然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài),。直至找到細(xì)胞好的形態(tài)為止,。4. 至于在培養(yǎng)瓶中加入多少培養(yǎng)基量，則需要實(shí)驗(yàn)汪們自己去摸索的,。對(duì)于生長(zhǎng)快的細(xì)胞,，易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好,，但是要注意對(duì)換液時(shí)間的把握,。5. 如何選擇培養(yǎng)瓶：一般，生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài),，那么采用塑料瓶會(huì)比玻璃瓶的效果好,；生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞,，用玻璃瓶培養(yǎng)的效果會(huì)更好。因此,，對(duì)于同一種細(xì)胞,，在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候（比如細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)或者原代培養(yǎng)），塑料瓶會(huì)好一點(diǎn),；而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候,，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。6. 細(xì)胞凍存時(shí),，蓋子要擰緊,，不然復(fù)蘇水浴時(shí)會(huì)滲水，造成細(xì)胞污染,。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子,、型號(hào)的管子會(huì)有差別），蓋子擰緊后最好用封口膜封住,。且每支凍存管都要標(biāo)上細(xì)胞的名稱(chēng),、凍存時(shí)間，并記錄在冊(cè),，以免后續(xù)復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),，取錯(cuò)細(xì)胞。7. 細(xì)胞凍存時(shí)要嚴(yán)格進(jìn)行梯度降溫（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）,。要知道冰火兩重天的生活環(huán)境只會(huì)讓嬌弱的細(xì)胞自爆身亡，謹(jǐn)記：緩降溫,！但如果真心趕時(shí)間時(shí),，可用使用細(xì)胞凍存盒進(jìn)行細(xì)胞凍存，而后盡快將其轉(zhuǎn)入液氮中,。此外,，要定期測(cè)量液氮罐里的液氮儲(chǔ)備，以保證細(xì)胞全部浸在液面下,。8. 細(xì)胞解凍時(shí),，由于凍存管管壁較厚、隔熱,，而導(dǎo)致水浴時(shí)間太長(zhǎng)（2min還沒(méi)融化）時(shí),，可以將水浴鍋的溫度調(diào)至40℃左右，可以縮短解凍時(shí)間,。9. 提前預(yù)定超凈臺(tái),，減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間，可避免細(xì)胞房人滿(mǎn)為患,，超凈臺(tái)使用緊張,，復(fù)蘇1h后,，還沒(méi)有加入新的培養(yǎng)液。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶,，凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞,，但復(fù)蘇融解后，浸泡時(shí)間太久會(huì),，對(duì)細(xì)胞有毒性）10. 復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)一定要有耐心,，因?yàn)橛行┘?xì)胞在復(fù)蘇一星期后才會(huì)真正有起色。因而,，盡管細(xì)胞在復(fù)蘇三四天后沒(méi)有任何動(dòng)靜,，也不要輕易倒掉所有細(xì)胞，要耐心等待,，兩周后再做決定,。11. 有關(guān)DMSO的一些注意事項(xiàng)：DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn),、延緩凍存過(guò)程,，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)的離子濃度、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少細(xì)胞損傷程度,。DMSO在溶解過(guò)程中會(huì)放熱，應(yīng)先與培養(yǎng)基混勻后再加血清,，同時(shí)凍存液最好提前配置,，DMSO現(xiàn)配對(duì)細(xì)胞的毒性可能更大；復(fù)蘇時(shí),，要離心去除DMSO,，并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌1-2次，注意離心的時(shí)候速度不要太快,。細(xì)胞培養(yǎng)小技巧今天就講到這里,。你可以先把這篇文章保存下來(lái)，當(dāng)你遇到問(wèn)題的時(shí)候再來(lái)看也許會(huì)更有感覺(jué),。
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