本文圍繞蛋白質(zhì)純度的重要性,，闡述了蛋白類雜質(zhì)的檢測方法，包括電泳法,，色譜法,，沉降速率測定法，質(zhì)譜法,，光散射法,。任何方法都不能直接定量蛋白質(zhì)樣品的純度。無論最終目的是為了解釋分析數(shù)據(jù),、驗(yàn)證過程質(zhì)量,，還是為了確保生物制劑產(chǎn)品的安全性，樣品純度的測定都是至關(guān)重要的環(huán)節(jié),。

隨著蛋白類生物制品的發(fā)展,，蛋白質(zhì)純度已經(jīng)成為藥品管理的重大問題。在生物制品的質(zhì)量指導(dǎo)原則中指出：除了評價原料藥和藥物產(chǎn)品的純度,，可能由預(yù)期產(chǎn)品和多種產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)組成之外,，還應(yīng)評價可能出現(xiàn)的雜質(zhì)成份。這些雜質(zhì)可能是在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的或者是與產(chǎn)品相關(guān),，它們的結(jié)構(gòu)可能是已知的,、定性的，亦或是未知的,。

在評價樣品純度之前,，首先要鑒定待測雜質(zhì)的類型，如核酸,、碳水化合物,、脂質(zhì),、無關(guān)蛋白質(zhì)、同工酶類,、失活蛋白質(zhì),，進(jìn)而確定在待測溶液中，能夠區(qū)分假定雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(化學(xué)分析或物理特征),。純化過程中可能已將某一雜質(zhì)的濃度降低到檢測限以下,，但色譜峰中還有殘留。毫無疑問,，表觀純度取決于所選擇的測定方法及其靈敏度,。大多數(shù)的分離方法都能有效的去除非蛋白類雜質(zhì),，下面簡單介紹蛋白質(zhì)樣品中蛋白類雜質(zhì)的檢測方法,。

1、電泳法

電泳法簡單,、成本低,，并且在確定樣品中蛋白質(zhì)組分?jǐn)?shù)目方面靈敏度高，因此尤為常見,。通常被用于蛋白質(zhì)純度鑒定的第一步篩選,，甚至應(yīng)用于初期高異質(zhì)性的樣品鑒定。如果預(yù)期雜質(zhì)與目標(biāo)蛋白的分子量有差距,，SDS凝膠電泳可以分辨出雜質(zhì),。對于分子量相近但氨基酸組成不同的分子，SDS凝膠電泳一般分不開,，但在非變性凝膠電泳中可以根據(jù)其不同的電泳遷移率進(jìn)行鑒定,。

然而，在采用該方法時也需要注意一些潛在的問題,。對于變性凝膠,，可能出現(xiàn)假陰性和假陽性現(xiàn)象。如果發(fā)生雜質(zhì)共遷移或雜質(zhì)無法進(jìn)入凝膠的情況,，會出現(xiàn)假陰性,。因此應(yīng)該將整塊膠，包括濃縮膠和分離膠都染色,，并且需要檢驗(yàn)蛋白質(zhì)燃料是否合適,。而假陽性的產(chǎn)生，可能是由于在樣品制備時發(fā)生共價修飾,，或者膠不均一或氧化劑殘留,。同時在非變性凝膠中也會出現(xiàn)類似問題。如果雜質(zhì)的靜電荷為零或者與目標(biāo)蛋白相反,，雜質(zhì)將不會出現(xiàn)在膠上,，可以通過加寬非變性凝膠電泳的PH范圍來解決,。

2、色譜法

2.1 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法是檢測與目的蛋白分子量大小不同雜質(zhì)的簡單方法之一,。此方法無破壞性并且非?？焖佟Ｒ?yàn)榇朔椒闃悠穮^(qū)分法,，樣品通過凝膠柱時會被稀釋,，因此檢測的樣品需要有一定的起始濃度。而具體的檢測量則取決于檢測雜質(zhì)時的靈敏度,。

凝膠過濾色譜法檢測分子大小的靈敏度低于電泳法,，實(shí)驗(yàn)需要的材料量大于電泳法。由于凝膠過濾色譜通常在天然狀態(tài)下進(jìn)行,，結(jié)果可以反映樣品的異質(zhì)性,。但如果蛋白質(zhì)以穩(wěn)定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶)，在凝膠過濾色譜時將表現(xiàn)出異質(zhì)性,。同時,，快速、可逆自聯(lián)作用的蛋白質(zhì)也會表現(xiàn)出異常濃度的洗脫譜,。在出現(xiàn)這樣情況的時候,，可以從不對稱或加寬峰中選取不同部分來重復(fù)凝膠過濾色譜。

2.2 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法（reversed phase HPLC）,，是利用如改性硅介質(zhì)等非極性基質(zhì)作為固定相,，通過流動相中的有機(jī)溶劑減少了蛋白質(zhì)與固定相的親和力，進(jìn)行極性遞減的梯度洗脫,，從而將蛋白洗脫下來,。

由于該方法簡單并且迅速，同時有現(xiàn)成的儀器設(shè)備,，能夠靈活應(yīng)用于多種不同特性的蛋白質(zhì)分離,，因此此方法已普遍用于蛋白質(zhì)樣品的純度測定。如果有需要,，還可以通過改變流動相使樣品在不同梯度及條件下分離,，來確定主要目標(biāo)物的純度。

3,、沉降速率測定法

沉降速度法,，能夠簡單并且快速非破壞性的來測定蛋白質(zhì)的純度，同時對分子質(zhì)量和分子大小的比值非常靈敏,。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于,，測定范圍非常的廣；但局限在于,，對相對分子質(zhì)量相差小的樣品做測定時,，靈敏度低于電泳技術(shù),。

4、質(zhì)譜法

質(zhì)譜法可以直接測定一個樣品中共價質(zhì)量的分布,，此方法能夠方便簡便,、靈敏的測定雜質(zhì)。質(zhì)譜法不僅可以檢測雜質(zhì)的存在,，還可以描述雜質(zhì)的質(zhì)量特征,，因此質(zhì)譜法常被用于鑒定雜質(zhì)的來源。通過串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）,，可以鑒定共價改性修飾特征和位點(diǎn),。由于雜質(zhì)可能與主要目標(biāo)物有相似的質(zhì)荷比，將質(zhì)譜法與其他方法(如凝膠分離色譜)聯(lián)用,，可以增加樣品純度測定的準(zhǔn)確性,，達(dá)到*佳的效果。

5,、光散射法

目前一些儀器能夠通過靜態(tài)或動態(tài)光散射來測定單個樣品,，或者監(jiān)測高效液相色譜和場級分離過程,。通過對分子大小和表觀分子質(zhì)量的連續(xù)測定,，增強(qiáng)鑒定洗脫蛋白質(zhì)的能力，以區(qū)分待分析物,、待分析物的多聚體或雜質(zhì),。光散射法非常簡單且無破壞性，同時能夠提供洗脫時間函數(shù)的分子質(zhì)量圖,。如果紫外檢測峰不對稱,，通過多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析,，有可能表現(xiàn)峰的主要部分表觀分子量為mol/L,，而邊緣為2mol/L，說明可能存在二聚體,。但出現(xiàn)倍數(shù)分子質(zhì)量不一定能證明一定存在自身結(jié)合,，還需要采用不同的方法驗(yàn)證此結(jié)果。

任何方法都不能直接定量蛋白質(zhì)樣品的純度,。通常情況下,，蛋白質(zhì)純度測定涉及評價待定雜質(zhì)的含量或僅僅驗(yàn)證蛋白質(zhì)樣品中是否存在雜質(zhì)。無論最終目的是為了解釋分析數(shù)據(jù),、驗(yàn)證過程質(zhì)量,，還是為了確保生物制劑產(chǎn)品的安全性，樣品純度的測定都是至關(guān)重要的環(huán)節(jié),。