流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry,，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。

一,、基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀由三部分構(gòu)成
1.液流系統(tǒng),，包括流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng);
2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng);
3.電子系統(tǒng),，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),。流式細(xì)胞儀的I作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角,、側(cè)向散射角和不同熒光強(qiáng)度的電脈沖信號,，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理形成相應(yīng)的點(diǎn)圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析,。用于FCM的樣本是單細(xì)胞懸液,，可以是血液、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液,、各種體液,、新鮮實(shí)體瘤的單細(xì)胞懸液以及石蠟包埋組織的單細(xì)胞懸液等。

二,、流式細(xì)胞術(shù)的基本操作與技巧
1）細(xì)胞的制備,、培養(yǎng)
2）封閉
3）熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記
4）光電倍增管電壓的設(shè)定
5）對照的設(shè)置
6）補(bǔ)償調(diào)節(jié)

以體外培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞為例：
1、細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中,，直接收集細(xì)胞于1.5ml的EP管中,，350g，4°C離心5min,，棄上清,；
2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀,，350g,，4°C離心5min,，棄上清；
3,、封閉：標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體,，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成,，即包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段和相對保守的Fc段,，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子特異性結(jié)合,，從而標(biāo)記并且相對量化細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況,。但是，有些細(xì)胞表面表達(dá)FcR(Fc receptor, Fc受體）,，如巨噬細(xì)胞,、DC、B淋巴細(xì)胞等,， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進(jìn)行非特異性的結(jié)合,，對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

封閉方法1： 取適量的血清全I(xiàn)gG抗體與樣品細(xì)胞充分混勻,，4'C靜置 15min,。研究人的細(xì)胞時，若熒光素偶聯(lián)抗體來源于小鼠,，封閉采用小鼠血清全I(xiàn)gG抗體,。原則是，如果流式抗體可能與樣品細(xì)胞的FcR發(fā)生非特異性結(jié)合,，那么在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前先用流式抗體同源的全I(xiàn)gG抗體進(jìn)行封閉,，使樣品細(xì)胞表面的FcR飽和。

封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細(xì)胞充分混勻,，4'C靜置 15min,。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力較強(qiáng),；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合,，親和力中等。而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體,，所以在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細(xì)胞,，使樣品細(xì)胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結(jié)合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結(jié)合,。

4,、標(biāo)記相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例,，一般染色體系推薦100μl,，CD3、CD4表達(dá)量相對較高,，1μl足夠了,，假如有9個樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7,、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中,，混勻后，分別取100μl加到9個樣品孔中,，混勻,，室溫、避光染色20min,；

5,、加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，350g,，4°C離心5min,，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀,，盡快上機(jī)分析。

6,、電壓的設(shè)定：上機(jī)分析時,，確認(rèn)機(jī)器沒有問題后，首先就是調(diào)節(jié)每個通道的光電倍增管的電壓,，目的是為了區(qū)分細(xì)胞群,，假如我們想研究人的淋巴細(xì)胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細(xì)胞,、單核細(xì)胞還有中性粒細(xì)胞等,，那我們怎么把它們分開呢？這時候就要用到我們前面提過的FSC和SSC,，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓,，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，原則就是使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置,。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調(diào)節(jié)APC-cy7,、FITC的電壓（我們可以在鋪細(xì)胞的時候多鋪一個孔，染色時將CD3-APC-cy7,、CD4-FITC均染上,，用于FSC、SSC,、APC-cy7,、FITC電壓的調(diào)節(jié)）,，原則就是使陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。

三,、注意事項(xiàng)

（1）在細(xì)胞制備,、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞,，需用先用胰酶消化細(xì)胞,，然后收集待測樣品細(xì)胞，離心,、洗滌,、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

（2）如果是胸腺,、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官,，主要由免疫細(xì)胞組成，制成單細(xì)胞懸液,，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可,。

（3）如果是實(shí)體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織,，實(shí)體臟器細(xì)胞之間一般結(jié)合緊密,，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細(xì)胞懸液。因此,，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化,，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實(shí)體臟器研磨后的單細(xì)胞懸液以實(shí)體細(xì)胞為主,，如果研究目標(biāo)不是實(shí)體細(xì)胞,，而是臟器內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細(xì)胞,，然后再進(jìn)行流式分析,。

（4）調(diào)節(jié)電壓時，如果檢測的目標(biāo)細(xì)胞體積較小,，可以適當(dāng)提高電壓值,，使目標(biāo)細(xì)胞與細(xì)胞碎片在流式圖中能夠*分離；如果檢測的目標(biāo)細(xì)胞體積較大,，可以適當(dāng)降低電壓值,，使所有的目標(biāo)細(xì)胞群完整顯示于流式圖中，防止細(xì)胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者*處于邊界外,。

（5）關(guān)于樣本的封閉,，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細(xì)胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標(biāo)記人的細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來源于小鼠,，人細(xì)胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合,，但是，也有可能因?yàn)榉N屬關(guān)系較近,，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合,，實(shí)驗(yàn)者很難判斷實(shí)驗(yàn)過程中這種結(jié)合是否會發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結(jié)合一定不會發(fā)生,。所以,，條件允許的話，實(shí)驗(yàn)者最好養(yǎng)成封閉樣品的習(xí)慣,。