ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定,。但ELISA測(cè)定中影響因素較多,，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外,，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果,。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素；②試劑因素,；③操作因素,。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。
    1．樣品稀釋
    酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),，如果血清不稀釋,，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性,。因此,，國外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),，以降低非特異性反應(yīng),，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定,，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性,。但是,，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作,，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋,，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問題。
    2．試劑盒平衡
    試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃),，一般需在室溫放置20～30分鐘以上,。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短,，ELISA反應(yīng)不夠充分,。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘,。
    3．樣品和試劑的混勻
    稀釋前,、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻,，以保證試驗(yàn)的均一性,。
    4．加樣
    在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟,。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡,。加樣太快,，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異,。所以,，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽性，下次測(cè)定為陰性,，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致,。
    5．溫育
    溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定,，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間,。溫育所需時(shí)間與溫度成反比,，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短,。尤為常用的溫育溫度有37℃和室溫,，其次是43℃和2～8℃,。一些操作者，擅自改變說明書操作,，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度,，這樣造成一些不必要的麻煩。因?yàn)?，不同試劑盒有不同的溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇,，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。
    6．洗板
    固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù),，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來說,，也是極其關(guān)鍵的一步,。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,，甩去板孔中洗液后,，一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙,，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。
    7．邊緣效應(yīng)
    使用96孔板的ELISA測(cè)定中,，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”,，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所,。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體,，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱,，板也升溫時(shí),，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí),，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃）,，就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性,。
    8．顯色
    顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說明操作即可,。一般來說，顯色時(shí)間過短,，結(jié)果偏低,；顯色時(shí)間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。
    9．比色
    比色要注意波長的選擇,。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,，而前者比色波長為450nm，后者為492nm,，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此,，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題,。
    其次，單波長或雙波長比色選擇的問題,。所謂的單波長比色即是通常的以對(duì)顯色具有吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定,；而雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋,、刮痕,、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測(cè)定即改變波長至一定值,，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零,，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差,。因此,，雙波長比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收,、指紋,、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn),。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性,，也就是說每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí),，是使用雙波長比色,。