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細(xì)胞冷凍保存常識

時間：2022-1-18閱讀：1989

1.1.欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)在生長良好的指數(shù)生長期且高存活率,，約為80-90%的匯合度。

1.2.冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如雜交瘤細(xì)胞應(yīng)在冷凍保存前一至二日測

試是否有抗體之產(chǎn)生,。

1.3.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,，無菌且無色,。4℃避光保存，勿作多次解凍,。甘油亦應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性,。

1.4.冷凍保存之細(xì)胞濃度： DMSO 的濃度介于 5%~20% 之間。生長培養(yǎng)液的體積應(yīng)調(diào)整以適于所用細(xì)胞保護(hù)劑的變化,。

1.4.1.正常人成纖維細(xì)胞:1-3×106 cells/ml

1.4.2.雜交瘤細(xì)胞:1-3x106cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤細(xì)胞會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后si去,。

1.4.3.貼壁的腫瘤細(xì)胞系:5-7x106cells/ml,，依細(xì)胞種類而異。腺癌解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1-3×106cells/ml,。

1.4.4.其他懸浮細(xì)胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte須至少5×106cells/ml。

1.5.冷凍保護(hù)劑濃度為5%或10%DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同

時,，亦應(yīng)作一個對照培養(yǎng)，以防止冷凍失敗,。+n6

2.細(xì)胞冷凍保存的具體操作

2.材料：

2.1.生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞

2.2.新鮮培養(yǎng)基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無菌塑料冷凍保存管

2.5.0.4％ w/v臺盼藍(lán)

2.6.血球計數(shù)盤與蓋玻片

2.7.等速降溫機(KRYO10SeriesII)

3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,，觀察細(xì)胞生長情形。

3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,，最后濃度為5-10％,，

混合均勻，置于室溫下待用,。

3.3.依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約20ul)計數(shù)細(xì)胞濃

度及凍前存活率,。

3.4.離心,，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液,，對應(yīng)細(xì)胞適合的凍存密度混合均勻,，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/管,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測,。

3.5.冷凍保存方法：在每一個凍存管上注明細(xì)胞系的名字，凍存者姓名和凍存時間,，方便日后尋找,。將一批細(xì)胞用橡皮筋捆綁住，用足夠多的棉花將凍存管包裹,，包括燒杯的底座和瓶頂,，保護(hù)細(xì)胞逐級冷卻，防止過快冷凍產(chǎn)生的冰晶破壞細(xì)胞狀態(tài),，放入-80℃冷凍,，然后放置于液氮中。