為什么要進(jìn)行細(xì)胞凍存,？

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái),，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,，起到了細(xì)胞保種的作用,。

除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)購(gòu)買(mǎi)、寄贈(zèng),、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞,。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低,，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成,，從而避免細(xì)胞損傷,。 

采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開(kāi)始為-1 到 -2℃/min,，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速,，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

細(xì)胞凍存的步驟

（1）選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，在凍存前一天最好換液,。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化,。適時(shí)去掉胰蛋白酶,，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞,，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液,。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min,，10分鐘),。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基,，于4℃預(yù)冷15分鐘后,，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，細(xì)胞濃度為5×10⁶～1×10⁷/mL之間。
（3）將分裝上述細(xì)胞懸液于2ml凍存管中,，每管0.25ml,。凍存管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱(chēng)和凍存日期,，同時(shí)作好登記（日期,、細(xì)胞種類(lèi)及代次、凍存支數(shù)）,。
（4）將裝好細(xì)胞的凍存管放到凍存盒中,，-80℃冰箱過(guò)夜。；如果有程序降溫器(放在-80℃冰箱過(guò)夜,，放入液氮罐)最好;或者可以在4℃,，2h;然后轉(zhuǎn)到-20℃，2h;-80℃,，2h;放入液氮罐,。
（5）細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn),，凍存半年后,，最好取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況,，然后再繼續(xù)凍存,。

如何進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中,，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化,。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子,，用吸管吸出細(xì)胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻;

3. 離心,， 1000rpm,，5min;

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶,，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);

5. 次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng)。