雙抗

一、什么是雙抗,？

青霉素加上鏈霉素,，俗稱“雙抗"。

二,、培養(yǎng)液中需要加入雙抗嗎,？

加不加雙抗不是絕對的，視實際情況而定,。

如果你實驗室條件足夠好，如果你操作足夠規(guī)范,，就盡量不要加雙抗了,。

相反，如果你實驗條件不夠,，操作也沒有絕對把握,，還是加的好。

好的方法是做個實驗對照,，看有沒有必要加雙抗,。

三、如何加雙抗,？

加在DMEM里,，因為如果是直接在換液傳代滴加的話，那個雙抗的濃度實在不好控制,，如果加多了話對細(xì)胞毒性太大,，如果擔(dān)心時效，可以Z在培養(yǎng)液配好后分裝于100ml的小玻璃瓶中,，在每啟用一瓶之前加,，加了之后應(yīng)盡快用完。

胰酶

一,、胰酶使用的時候要注意什么,？

1,、在使用胰酶細(xì)胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細(xì)菌污染。

2,、胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時間不宜過長,，否則細(xì)胞鋪板后生長狀況會較差。

二,、以貼壁細(xì)胞的消化為例：

1,、吸去培養(yǎng)液，用無菌的PBS,、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,，以去除殘余的血清；

2,、加入少量胰酶細(xì)胞消化液,，略蓋過細(xì)胞即可，根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量,。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細(xì)胞消化時間有所不同）

3,、顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮,，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀,；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。

4,、此時吸除胰酶細(xì)胞消化液,。加入含血清的*細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞,，即可直接用于后續(xù)實驗如果發(fā)現(xiàn)消化不足,，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時間過長,，未及吹打細(xì)胞,，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來,。1000-2000g離心1分鐘,，沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后,，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,，即可用于后續(xù)實驗。

常用的細(xì)胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin）,，EDTA等,，其功能主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞外基質(zhì)）水解，改變細(xì)胞間的連接,，使組織或細(xì)胞片分散成單個細(xì)胞,，制成細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步的實驗,。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件,、凍存或4℃保存時間長短,、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等）,、消化時的溫度（氣溫,、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液,，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定）,，以使充分浸潤；

一般消化時間約為1至3分鐘,，肉眼觀察瓶底由半透明（細(xì)胞單層連接成片）轉(zhuǎn)為透明,、點狀（出現(xiàn)細(xì)小空隙）時，棄去細(xì)胞消化液,，或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可,。并加入適量的*培養(yǎng)液終止消化，吹打分散,；如見大量細(xì)胞片狀脫落,，已消化過頭，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作,。（消化過頭,，可造成大量細(xì)胞從瓶壁上脫下，甚至造成細(xì)胞破碎,。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，所以加入*培養(yǎng)基可以終止反應(yīng),。