養(yǎng)細胞可謂是個精細活，從事養(yǎng)細胞的人都知道養(yǎng)細胞的時候一旦不注意,，就很容易造成細胞污染,，所以想要養(yǎng)好細胞除了小心謹慎以外,，還要提前做好準備：
       細胞培養(yǎng)前的準備
       1）在帶上手套開始細胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風險,。
       2）細胞培養(yǎng)基也應先預熱,選擇只預熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實驗時間,而且可以避免因反復加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質降解,。

       3）結束操作后,別忘了培養(yǎng)基對光敏感,應盡可能避光保存。

       細胞培養(yǎng)的定期檢查
       1）定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài),，即形狀和外觀,，對于細胞培養(yǎng)實驗取得成功至關重要。
       2）除確認細胞的健康狀態(tài)外,，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象,，避免污染擴散至實驗室其他細胞。
       細胞變質的征象
       1）細胞變質的征象包括核周出現(xiàn)顆粒,、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成,。
       2）這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染,、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質,，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

       3）變質嚴重時將會成為不可逆的變化,。

       細胞培養(yǎng)通風櫥的消毒及布局
       1）保持細胞培養(yǎng)通風櫥內(nèi)的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內(nèi),。
       2）向放入通風櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇,，擦拭清潔進行消毒。
       3）在通風櫥中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器,；移液器置于右前方易于取用,；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸取,；試管架置于中后部,；小型容器置于左后部用于盛放廢液。
       培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作
       1）無菌培養(yǎng)瓶,、試劑瓶,、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中,，操作完成后盡快蓋上蓋子,，取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。
       2）進行無菌操作時不要說話,、唱歌或吹口哨,。盡快完成實驗，以盡量避免污染,。
       細胞培養(yǎng)中可能的污染物
       1）細胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：
        a.化學污染物,如培養(yǎng)基,、血清和水中的雜質,、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑,。
        b.生物污染物,，如細菌、霉菌,、酵母,、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染,。
        c.可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術,，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。
        交叉污染的確認
        1)交叉污染雖不如微生物污染普遍,，但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題,，會造成嚴重后果。
        2)從聲譽好的細胞庫獲取細胞系,、定期檢查細胞系性質及采用良好的無菌技術有助于避免交叉污染,。
        3)通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染,。
        細胞換液注意事項
       1)為細胞換液時,，要沿著培養(yǎng)瓶的一側輕輕地加入，而不是直接加到細胞中,，以免損傷細胞,，當培養(yǎng)的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。
       2)使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時,，每支吸管只能使用一次,，以免交叉污染。
       細胞傳代的時間把握
       1)當細胞呈指數(shù)增殖,，貼壁培養(yǎng)的細胞已占據(jù)所有可用基質,、沒有擴增空間，或懸浮培養(yǎng)的細胞已超過培養(yǎng)基質所支撐的能力,，無法進一步生長時,，細胞增殖速度將大大降低甚至*停止。
       2)為了將細胞密度維持在最佳水平,，以便細胞繼續(xù)生長,，并且刺激進一步增殖，必須對細胞進行傳代,。
       細胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項
      1)細胞培養(yǎng)時不應長期使用抗生素,，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在,。
      2)抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用,，并盡快撤除,。
      3)如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng),，以便作為鑒別隱性感染的對照,。
       細胞凍存的必要性
       1)連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系最終會發(fā)生衰老,，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染,，即使運轉情況很好的實驗室也會遇到設備故障的問題。

       2)由于已建立的細胞系是一種寶貴資源,，更換細胞系成本高昂,，而且耗費時間，因此,，必須將其冷凍起來,，長期保存。

       細胞凍存的事項
       1)應在細胞濃度高的情況下進行細胞培養(yǎng)凍存,，并且細胞傳代的次數(shù)盡可能少,。
       2)在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%,。請注意,，最佳凍存條件取決于所用細胞系。
       3)凍存和復蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影響,，因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細胞脫落（培養(yǎng)昆蟲細胞時除外）,，也不要高速離心細胞。
       凍存培養(yǎng)基的選擇
       1)凍存細胞時必須選擇凍存培養(yǎng)基,，凍存培養(yǎng)基中應含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。
       2)還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基,，例如HyClone,、Gibco的細胞凍存培養(yǎng)基。
       細胞培養(yǎng)溫度的設定
      1)細胞培養(yǎng)的最佳溫度主要取決于細胞供體的體溫,，此外也受到解刨部位體溫差異的影響,，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。
      2)與溫度過低相比,，細胞培養(yǎng)時溫度過高時更為嚴重的問題：因此,，往往將培養(yǎng)箱的溫度設定為略低于最佳溫度。
      各類細胞培養(yǎng)的最佳溫度
      1)大多數(shù)人和哺乳動物細胞系在36℃~37℃下具有最佳生長狀態(tài),。
      2)昆蟲細胞在27℃具有最佳生長狀態(tài),；在低于27℃以及27至30℃范圍內(nèi)，細胞生長較慢,。
      3)溫度超過30℃時,，昆蟲細胞活力降低,，即使溫度降至27℃，細胞活力也無法恢復,。
      4)禽類細胞系在38.5℃時具有最佳生長狀態(tài),。雖然此類細胞也可在37℃下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢,。
      5)來源于冷血動物（例如：兩棲動物,、冷水魚）的細胞系可耐受很寬的溫度范圍，為15-26℃,。
      6)請注意每種細胞的培養(yǎng)條件均有所不同,，偏離某種細胞所需的培養(yǎng)條件會導致細胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗,。
       細胞培養(yǎng)的最適pH
       1)大多數(shù)正常的哺乳動物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好,，而且不同細胞株間差異極小,。
       2)但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時生長較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7,。
       3)Sf9和Sf21等昆蟲細胞系適合在pH值為6.2的環(huán)境中生長。
        細胞培養(yǎng)基最適pH的控制
       1)細胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值,，為培養(yǎng)的細胞緩沖pH值的變化,。這種緩沖作用通常是通過添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。
       2)由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡,，因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值,。
       3)為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時必須使用外源性二氧化碳,，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞或者進行高濃度的轉化細胞系培養(yǎng)時,。
        細胞培養(yǎng)中血清的保存
        1)細胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細胞種類和培養(yǎng)要求來挑選出適合的血清,。建議將血清保存在-10至-20℃,，若存放于4℃，請勿超過一個月,。若無法一次用完一瓶,，建議您將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內(nèi)，再放回冷凍箱保存,。
       2)解凍血清時,，建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過夜融解,，然后在室溫下使之全融,。需要注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。
        如何在細胞鋪板時避免“邊緣效應"
        1)細胞實驗鋪板時,，為避免“邊緣效應",，以應用96孔板的中間60孔為最佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細胞,，只做空白或陰性對照,。
        2)鋪板時，細胞懸液一定要混勻,，以避免細胞沉淀下來而導致每孔中的細胞數(shù)量不等,，可以每接幾個就再混勻一下。
        3)加樣器操作要熟練,，盡量避免人為誤差,。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力,。所以要熟練操作,，盡快上板。
        何時選擇使用熱滅活血清
        1)加熱血清可以滅活補體系統(tǒng),。
        2)啟動的補體參與溶解細胞事件,，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺,，啟動淋巴細胞和巨噬細胞活化,。
        3)在免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞,、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,，推薦使用熱滅活血清。
         熱滅活血清可能出現(xiàn)的現(xiàn)象
         1)在免疫學研究,、培養(yǎng)ES細胞,、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清,。而對于其他大多數(shù)的細胞來說是不需要熱滅活血清的,。
         2)熱滅活血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用,，甚至可能因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低,；經(jīng)過熱處理的血清,，沉淀物會顯著地增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,，像是“小黑點",，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37度環(huán)境中，又會使此沉淀物增多,，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增,。
         3)根據(jù)自己的研究需要是否需要熱滅活血清。如此一來,，不但能確保血清的質量,，而且能夠節(jié)省實驗時間。
         如何正確熱滅活血清
         1)熱滅活時請將血清置于56℃水浴30分鐘,。
         2)為盡量減少熱滅活對血清品質的影響,，一次滅活的血清體積不宜過大。

         3)最好準備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度）,，滅活時將裝有血清和水的容器同時放入56℃水浴,，在裝水的容器中放置溫度計，加熱過程中不時地輕輕旋轉混勻血清,，當溫度計顯示達到56℃左右,，開始計時。