1、ELISA試驗的穩(wěn)定性問題?

　　做ELISA實驗時,，結(jié)果老是重復(fù)性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的結(jié)果就截然不同,，上午做時其OD在1.5,，下午做時就是0.9了,，所以都沒有辦法下結(jié)論，為什么會差異這么大呀,？?

　　（1）多設(shè)平行空孔,，?請別人代勞,，以判斷究竟是否操作問題?

　?。?）對于活性非常高的包被物和酶標記物，如果第一次選擇的范圍恰好在其平臺位置邊

　　緣,，那么在重復(fù)的時候,，每次取樣帶來的微量誤差就很容易導(dǎo)致大的偏差了,，特別是線性比較好的原料試劑，這個就很正常了,。建議每次取樣的時候只使槍尖一點點位于液面下,，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗體or酶而使結(jié)果重復(fù)不上,。?

　　2、酶不穩(wěn)定,，有何高招,？?

　?。?）保存濃度盡量高些，?

　?。?）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保護劑,，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解,。?

　　（3）加入50%甘油-20度保存,、避免反復(fù)凍融。?

　?。?）還可以加入防腐劑防止長菌（注意不能用疊氮鈉,，其對HRP活性有很大影響）?（5）現(xiàn)在一些公司也有商品化的酶標保護劑供應(yīng),，可以考慮一下?酶類的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定,，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化，貯藏要求簡單,，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可,。液態(tài)穩(wěn)定性較差，貯藏時應(yīng)注意以下幾點：?1,、樣品不能太稀,，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,，樣品太稀易降解、變性,。?2,、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑,，酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖,、甘油等,，也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外,，鈣、鋅,、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用,。?3,、貯藏溫度要求低，避免反復(fù)凍融,。??

　　3、ELISA試驗中不加標本的OD值反而高于加人的陰性標本的OD值,，是什么原因呀,？?

　　做夾心法ELISA試驗中不加標本的OD值反而高于加人的陰性標本的OD值,，是什么原因呀？?

　　最大的原因是封閉的效果不好,，應(yīng)該調(diào)整封閉液；?

　　可以嘗試不同的封閉劑（BSA,、膠脂奶粉、明膠等）,、不同的封閉濃度、時間,，試試哪個效果好?

　　陰性的里面的其他蛋白起到了封閉的效果??

　　4、邊緣的陰性O(shè)D值老是比中間的偏高,，什么原因呢,？?

　　我做ELISA時,，有一段時間在板的最后一條板孔的陰性的OD值經(jīng)常比在中間的高，有時候高出0.1個OD,，導(dǎo)致實驗經(jīng)常重復(fù)，但原因也找不到在哪里,？?

　　這可能是由于ELISA的邊緣效應(yīng)造成的。?ELISA的邊緣效應(yīng)是指邊緣孔與中心孔反應(yīng)條件不一致,，由于邊緣效應(yīng)的影響,，同一標本在邊緣孔測定的結(jié)果明顯高于中央孔，且隨邊緣孔與中央孔的距離的增加而增強,。原因在于試驗過程中邊緣孔與中央孔的溫度、液體蒸發(fā)程度不同以及各孔表面存在光潔度等物理性狀的差異有關(guān),。為克服其影響，應(yīng)盡可能使用中央孔及其周圍反應(yīng)孔,。ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達到平衡的水浴法,。?另外，酶標板也是一個比較重要的因素,，選擇質(zhì)量好一點的板能一定程度減少板內(nèi)誤差，我用costar的板,，到目前為止還沒有出現(xiàn)邊緣孔與中心孔反應(yīng)不均的情況,。??

　　5,、做ELISA對梯度怎么要求的啊,？?

　　做ELISA的時候老板讓我們選擇的抗原or抗體都是有明顯梯度的，不是很明白他們的觀點,，有時候稀釋不同的倍數(shù)但是活性相差不大，就象在一個平臺區(qū)段自己感覺在這么一個范圍里面都可以使用應(yīng)該更好,，這樣即使是有很小的取樣誤差也不會影響實驗,，應(yīng)該更好才對,！做ELISA對梯度這么要求究竟是什么目的，具體怎么要求的?。?

　?。?）?我們做ELISA試驗時是要求梯度比較明顯的才是好的抗原,，每個抗原都會有一

　　個最適平臺期,，就是在這個范圍之內(nèi)變化浮動不會很明顯，所以我們會選擇平臺期的起點不會選擇終點,。如果你沒有做到他的下限的話就不會知道抗原在哪個濃度時是平臺期的終點，有可能你選擇的是終點,，這樣就不是最佳的抗原濃度,。等到做穩(wěn)定性試驗時靈敏度應(yīng)該會下降的很明顯,。?

　　既然選擇的是平臺期的起點，那么也就是再往后是一個平臺期了,，那也不會有什么梯度了，這樣看得話有明顯梯度的,，如果處于下降階段的反倒沒什么用了,，這樣更難找平臺期的起點,？?

　　（2）?看你走的包被濃度的范圍怎么樣,，如果跨度很大的話，梯度就會很明顯,。反之,，

　　跨度小的話就不會有很明顯的梯度,，說明你應(yīng)該在這一段之間選擇最適濃度?

　　6、做elisa試劑盒一定要帶上陰陽性對照嗎,？對試劑盒起到什么作用？?

　　對照最最基本的作用是評價你的實驗體系：陰性對照驗證你的實驗是否存在污染造成假陽性,；陽性標本驗證你的實驗體系是否成立。?可以不做,，但出了問題你會抓不找頭緒,，不知道問題出在什么地方。此外,，如果作為實驗數(shù)據(jù)必須要有對照,。?

　　陽性對照品(positive?control)和陰性對照品(negative?control)是檢驗試驗有效性的控制品,，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品,，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定,，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底,。?陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì),。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性,。?陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì),，陽性判定值（cut-off?value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準,。?質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值,，一般定在正常值與異常值交界點上,，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值,。乙肝標志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求,，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標準,。?臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品,，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應(yīng)的標本不漏檢,。??

　　7,、把酶加到顯色劑中A和B中,，為什么在A中酶活性掉得比較慢,，但是在B中就掉得很快，是什么原因呢,？?

　　HRP的顯色試劑，不管是直接顯色的還是曝光的,，A液都是顯色底物，但不是直接與HRP作用的,，而是呈色/曝光的底物（DAB,，TMB,?Luminol等）,，它們的直接激活物是O2－,；B液一般是過氧化氫，這才是HRP的直接底物,。?整個HRP顯色的過程是：過氧化氫被HRP催化放出O2－，然后作用于呈色/曝光底物,，產(chǎn)生顏色/發(fā)光現(xiàn)象。由于過氧化氫性質(zhì)不穩(wěn)定,，所以不能將它與顯色/發(fā)光底物長時間保存一起,，所以一般的Kit都是裝成A,、B兩管。?

　　8,、夾心ELISA中本底高，該如何控制,？?

　　本人在夾心ELISA實驗中,，先用一種單抗包被ELISA板,，使用的酶標抗體是biotin標記的另一單抗,，但問題是本底高，該如何控制,？?

　　可能出現(xiàn)的原因有：?

　　1。單抗與后續(xù)的生物素標記的抗體發(fā)生了非特異性吸附,，所以加入HRP標記的鏈親和素時，導(dǎo)致OD值相應(yīng)增加,；?

　　2,。加入HRP標記的鏈親和素的濃度過高,，洗滌不*；?3,。封閉不*?

　　4,。生物素標記的抗體與封閉劑發(fā)生非特異性吸附??

　　9,、檢測腦鈉肽時為什么要加入EDTA和抑肽酶啊?

　　加入EDTA的目的是抗凝,獲取血漿進行分析.?

　　要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對待測物的降解,。